Ďakujeme za návštevu stránky nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať najnovšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, táto stránka nebude obsahovať žiadne štýly ani JavaScript.
Kostrové svalstvo je heterogénne tkanivo zložené prevažne z myofibríl, ktoré sa u ľudí typicky delia na tri typy: jeden „pomalý“ (typ 1) a dva „rýchle“ (typy 2A a 2X). Heterogenita medzi tradičnými typmi myofibríl a v rámci nich však zostáva nedostatočne pochopená. Použili sme transkriptomické a proteomické prístupy na 1050 a 1038 jednotlivých myofibríl z ľudského vastus lateralis. Proteomická štúdia zahŕňala mužov a transkriptomická štúdia zahŕňala 10 mužov a 2 ženy. Okrem izoforiem ťažkých reťazcov myozínu sme identifikovali metabolické proteíny, ribozomálne proteíny a bunkové spojovacie proteíny ako zdroje viacrozmernej variability intermyofibríl. Okrem toho, napriek identifikácii zhlukov pomalých a rýchlych vlákien, naše údaje naznačujú, že vlákna typu 2X sú fenotypovo nerozoznateľné od iných rýchlo sa sťahujúcich vlákien. Klasifikácia založená na ťažkých reťazcoch myozínu navyše nie je dostatočná na opis fenotypu myofibríl pri nemalínových myopatiách. Celkovo naše údaje naznačujú viacrozmernú heterogenitu myofibríl, pričom zdroje variácií siahajú aj za izoformy ťažkého reťazca myozínu.
Bunková heterogenita je inherentnou vlastnosťou všetkých biologických systémov, ktorá umožňuje bunkám špecializovať sa na uspokojenie rôznych potrieb tkanív a buniek.1 Tradičný pohľad na heterogenitu vlákien kostrového svalstva bol taký, že motorické neuróny definujú typ vlákna v rámci motorickej jednotky a že typ vlákna (t. j. typ 1, typ 2A a typ 2X u ľudí) je určený charakteristikami izoforiem ťažkého reťazca myozínu (MYH).2 Toto bolo spočiatku založené na ich nestabilite pH ATPázy,3,4 a neskôr na ich molekulárnej expresii MYH.5 Avšak s identifikáciou a následným prijatím „zmiešaných“ vlákien, ktoré koexprimujú viacero MYH v rôznych pomeroch, sa vlákna kostrového svalstva čoraz viac považujú za kontinuum a nie za odlišné typy vlákien.6 Napriek tomu sa táto oblasť stále vo veľkej miere spolieha na MYH ako primárny klasifikátor pre klasifikáciu myofibríl, čo je názor pravdepodobne ovplyvnený obmedzeniami a významnými skresleniami skorých štúdií na hlodavcoch, ktorých expresné profily MYH a rozsah typov vlákien sa líšia od tých u ľudí.2 Situáciu ďalej komplikuje skutočnosť, že rôzne ľudské kostrové svaly vykazujú rozmanitú škálu typov vlákien.7 Vastus lateralis je zmiešaný sval so stredným (a teda reprezentatívnym) profilom expresie MYH.7 Okrem toho je vďaka jednoduchosti odberu vzoriek najlepšie študovaným svalom u ľudí.
Nestranné skúmanie diverzity vlákien kostrového svalstva pomocou výkonných nástrojov „omics“ je preto kritické, ale aj náročné, čiastočne kvôli viacjadrovej povahe vlákien kostrového svalstva. Transkriptomické8,9 a proteomické10 technológie však v posledných rokoch prešli revolúciou v citlivosti vďaka rôznym technologickým pokrokom, ktoré umožňujú analýzu kostrového svalstva s rozlíšením jednotlivých vlákien. V dôsledku toho sa dosiahol významný pokrok v charakterizácii diverzity jednotlivých vlákien a ich reakcie na atrofické stimuly a starnutie11,12,13,14,15,16,17,18. Dôležité je, že tieto technologické pokroky majú klinické využitie, čo umožňuje podrobnejšiu a presnejšiu charakterizáciu dysregulácie spojenej s ochorením. Napríklad patofyziológia nemalínovej myopatie, jedného z najčastejších dedičných svalových ochorení (MIM 605355 a MIM 161800), je zložitá a mätúca.19,20 Preto by lepšia charakterizácia dysregulácie vlákien kostrového svalstva mohla viesť k významnému pokroku v našom chápaní tohto ochorenia.
Vyvinuli sme metódy transkriptomickej a proteomickej analýzy jednotlivých vlákien kostrového svalstva manuálne izolovaných zo vzoriek ľudskej biopsie a aplikovali sme ich na tisíce vlákien, čo nám umožnilo skúmať bunkovú heterogenitu vlákien ľudského kostrového svalstva. V priebehu tejto práce sme demonštrovali silu transkriptomického a proteomického fenotypizovania svalových vlákien a identifikovali sme metabolické, ribozomálne a bunkové spojovacie proteíny ako významné zdroje variability medzi vláknami. Okrem toho sme pomocou tohto proteomického pracovného postupu charakterizovali klinický význam myopatie nematód v jednotlivých vláknach kostrového svalstva, pričom sme odhalili koordinovaný posun smerom k neoxidačným vláknam nezávislým od typu vlákien na základe MYH.
Na preskúmanie heterogenity vlákien ľudského kostrového svalstva sme vyvinuli dva pracovné postupy, ktoré umožňujú analýzu transkriptómu a proteómu jednotlivých vlákien kostrového svalstva (obrázok 1A a doplnkový obrázok 1A). Vyvinuli a optimalizovali sme niekoľko metodologických krokov, od ukladania vzoriek a zachovania integrity RNA a proteínov až po optimalizáciu priepustnosti pre každý prístup. Pre analýzu transkriptómu sa to dosiahlo vložením molekulárnych čiarových kódov špecifických pre vzorku v počiatočnom kroku reverznej transkripcie, čo umožnilo zlúčenie 96 vlákien pre efektívne následné spracovanie. Hlbšie sekvenovanie (±1 milión čítaní na vlákno) v porovnaní s tradičnými prístupmi s jednou bunkou ďalej obohatilo transkriptómové dáta.21 Pre proteomiku sme použili krátky chromatografický gradient (21 minút) v kombinácii so zberom dát DIA-PASEF na hmotnostnom spektrometri timsTOF na optimalizáciu hĺbky proteómu pri zachovaní vysokej priepustnosti. 22,23 Na preskúmanie heterogenity zdravých vlákien kostrového svalstva sme charakterizovali transkriptómy 1 050 jednotlivých vlákien od 14 zdravých dospelých darcov a proteómy 1 038 vlákien od 5 zdravých dospelých darcov (doplnková tabuľka 1). V tejto práci sa tieto súbory údajov označujú ako transkriptómy s 1 000 vláknami a proteómy. Náš prístup detegoval celkovo 27 237 transkriptov a 2 983 proteínov v transkriptomickej a proteomickej analýze s 1 000 vláknami (obrázok 1A, doplnkové súbory údajov 1–2). Po filtrovaní transkriptomických a proteomických súborov údajov pre > 1 000 detegovaných génov a 50 % platných hodnôt na vlákno sa vykonali následné bioinformatické analýzy pre 925 a 974 vlákien v transkriptóme a proteóme. Po filtrovaní sa na jedno vlákno detegovalo v priemere 4257 ± 1557 génov a 2015 ± 234 proteínov (priemer ± SD) s obmedzenou interindividuálnou variabilitou (doplnkové obrázky 1B–C, doplnkové súbory údajov 3–4). Variabilita v rámci subjektu však bola u jednotlivých účastníkov výraznejšia, pravdepodobne kvôli rozdielom vo výťažnosti RNA/proteínu medzi vláknami rôznych dĺžok a prierezových plôch. Pre väčšinu proteínov (> 2000) bol variačný koeficient pod 20 % (doplnkový obrázok 1D). Obe metódy umožnili zachytiť široký dynamický rozsah transkriptov a proteínov s vysoko exprimovanými signatúrami dôležitými pre svalovú kontrakciu (napr. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (doplnkové obrázky 1E–F). Väčšina identifikovaných znakov bola spoločná medzi transkriptomickými a proteomickými súbormi údajov (doplnkový obrázok 1G) a priemerné intenzity UMI/LFQ týchto znakov boli primerane dobre korelované (r = 0,52) (doplnkový obrázok 1H).
Pracovný postup transkriptomiky a proteomiky (vytvorený pomocou BioRender.com). BD Krivky dynamického rozsahu pre MYH7, MYH2 a MYH1 a vypočítané prahové hodnoty pre priradenie typu vlákien. E, F Rozloženie expresie MYH naprieč vláknami v transkriptomických a proteomických súboroch údajov. G, H Grafy uniformnej diverzitnej aproximácie a projekcie (UMAP) pre transkriptomiku a proteomiku zafarbené podľa typu vlákien založeného na MYH. I, J Grafy prvkov znázorňujúce expresiu MYH7, MYH2 a MYH1 v transkriptomických a proteomických súboroch údajov.
Spočiatku sme sa snažili priradiť každému vláknu typ vlákna založený na MYH pomocou optimalizovaného prístupu, ktorý využíva vysokú citlivosť a dynamický rozsah expresie MYH v omických súboroch údajov. Predchádzajúce štúdie používali ľubovoľné prahové hodnoty na označenie vlákien ako čistých typov 1, 2A, 2X alebo zmiešaných na základe fixného percenta expresie rôznych MYH11,14,24. Použili sme iný prístup, v ktorom bola expresia každého vlákna zoradená podľa MYH, ktoré sme použili na typizáciu vlákien: MYH7, MYH2 a MYH1, čo zodpovedá vláknam typu 1, typu 2A a typu 2X. Potom sme matematicky vypočítali dolný inflexný bod každej výslednej krivky a použili sme ho ako prah na priradenie vlákien ako pozitívnych (nad prahom) alebo negatívnych (pod prahom) pre každý MYH (obrázok 1B–D). Tieto údaje ukazujú, že MYH7 (obrázok 1B) a MYH2 (obrázok 1C) majú výraznejšie profily expresie zapnutia/vypnutia na úrovni RNA v porovnaní s úrovňou proteínu. Na úrovni proteínov skutočne len veľmi málo vlákien neexprimovalo MYH7 a žiadne vlákno nemalo 100 % expresiu MYH2. Ďalej sme použili vopred určené prahy expresie na priradenie typov vlákien založených na MYH ku všetkým vláknam v každom súbore údajov. Napríklad vlákna MYH7+/MYH2-/MYH1- boli priradené k typu 1, zatiaľ čo vlákna MYH7-/MYH2+/MYH1+ boli priradené k zmiešanému typu 2A/2X (úplný popis pozri v doplnkovej tabuľke 2). Spojením všetkých vlákien sme pozorovali pozoruhodne podobné rozloženie typov vlákien založených na MYH na úrovni RNA (obrázok 1E) aj proteínu (obrázok 1F), zatiaľ čo relatívne zloženie typov vlákien založených na MYH sa u jednotlivých jedincov líšilo, ako sa očakávalo (doplnkový obrázok 2A). Väčšina vlákien bola klasifikovaná buď ako čistý typ 1 (34 – 35 %), alebo typ 2A (36 – 38 %), hoci bol detegovaný aj významný počet zmiešaných vlákien typu 2A/2X (16 – 19 %). Výrazným rozdielom je, že čisté vlákna typu 2X bolo možné detegovať iba na úrovni RNA, ale nie na úrovni proteínu, čo naznačuje, že rýchla expresia MYH je aspoň čiastočne regulovaná posttranskripčne.
Našu metódu typizácie vlákien MYH založenú na proteomike sme validovali pomocou bodkového blottingu na báze protilátok a obe metódy dosiahli 100 % zhodu pri identifikácii čistých vlákien typu 1 a typu 2A (pozri doplnkový obrázok 2B). Prístup založený na proteomike bol však citlivejší, účinnejší pri identifikácii zmiešaných vlákien a kvantifikácii podielu každého génu MYH v každom vlákne. Tieto údaje preukazujú účinnosť použitia objektívneho, vysoko citlivého prístupu založeného na omike na charakterizáciu typov vlákien kostrového svalstva.
Kombinované informácie poskytnuté transkriptomikou a proteomikou sme potom použili na objektívnu klasifikáciu myofibríl na základe ich kompletného transkriptómu alebo proteómu. Pomocou metódy uniform manifold approximation and projection (UMAP) na redukciu dimenzionality na šesť hlavných komponentov (doplnkové obrázky 3A–B) sme dokázali vizualizovať variabilitu myofibríl v transkriptóme (obrázok 1G) a proteóme (obrázok 1H). Je pozoruhodné, že myofibríly neboli zoskupené podľa účastníkov (doplnkové obrázky 3C–D) ani podľa dní testovania (doplnkový obrázok 3E) ani v transkriptomických, ani v proteomických súboroch údajov, čo naznačuje, že variabilita v rámci subjektu vo vláknach kostrového svalstva je vyššia ako variabilita medzi subjektmi. V grafe UMAP sa objavili dva odlišné zhluky predstavujúce „rýchle“ a „pomalé“ myofibríly (obrázky 1G–H). Myofibry MYH7+ (pomalé) boli zoskupené na kladnom póle UMAP1, zatiaľ čo myofibry MYH2+ a MYH1+ (rýchle) boli zoskupené na zápornom póle UMAP1 (obrázky 1I–J). Na základe expresie MYH sa však nerozlišovalo medzi typmi rýchlych myofibrylí (t. j. typ 2A, typ 2X alebo zmiešané 2A/2X), čo naznačuje, že expresia MYH1 (obrázok 1I–J) alebo iných klasických markerov 2X myofibrylí, ako napríklad ACTN3 alebo MYLK2 (doplnkové obrázky 4A–B), nerozlišuje medzi rôznymi typmi myofibrylí, keď sa berie do úvahy celý transkriptóm alebo proteóm. Navyše, v porovnaní s MYH2 a MYH7, len málo transkriptov alebo proteínov pozitívne korelovalo s MYH1 (doplnkové obrázky 4C–H), čo naznačuje, že početnosť MYH1 úplne neodráža transkriptóm/proteóm myofibrylí. Podobné závery sa dospeli pri hodnotení zmiešanej expresie troch izoforiem MYH na úrovni UMAP (doplnkové obrázky 4I–J). Zatiaľ čo vlákna 2X možno identifikovať na úrovni transkriptu iba na základe kvantifikácie MYH, vlákna MYH1+ sa nedajú odlíšiť od iných rýchlych vlákien, ak sa vezme do úvahy celý transkriptóm alebo proteóm.
Ako počiatočný prieskum heterogenity pomalých vlákien nad rámec MYH sme hodnotili štyri zavedené proteíny špecifické pre daný typ pomalých vlákien: TPM3, TNNT1, MYL3 a ATP2A22. Podtypy pomalých vlákien vykazovali vysoké, hoci nie dokonalé, Pearsonove korelácie s MYH7 v transkriptomike (doplnkový obrázok 5A) aj proteomike (doplnkový obrázok 5B). Približne 25 % a 33 % pomalých vlákien nebolo klasifikovaných ako čisto pomalé vlákna všetkými podtypmi génov/proteínov v transkriptomike (doplnkový obrázok 5C) a proteomike (doplnkový obrázok 5D). Preto klasifikácia pomalých vlákien na základe viacerých podtypov génov/proteínov predstavuje dodatočnú zložitosť, a to aj pre proteíny, o ktorých je známe, že sú špecifické pre daný typ vlákien. To naznačuje, že klasifikácia vlákien na základe izoforiem jednej rodiny génov/proteínov nemusí adekvátne odrážať skutočnú heterogenitu vlákien kostrového svalstva.
Aby sme ďalej preskúmali fenotypovú variabilitu vlákien ľudského kostrového svalstva v mierke celého omického modelu, vykonali sme nestrannú redukciu dimenzionality údajov pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA) (obrázok 2A). Podobne ako pri grafoch UMAP, ani účastník, ani deň testovania neovplyvnili zhlukovanie vlákien na úrovni PCA (doplnkové obrázky 6A–C). V oboch súboroch údajov bol typ vlákien založený na MYH vysvetlený pomocou PC2, ktorá ukázala zhluk pomalých vlákien typu 1 a druhý zhluk obsahujúci rýchle vlákna typu 2A, typu 2X a zmiešané vlákna 2A/2X (obrázok 2A). V oboch súboroch údajov boli tieto dva zhluky prepojené malým počtom zmiešaných vlákien typu 1/2A. Ako sa očakávalo, analýza nadmerného zastúpenia hlavných faktorov PC potvrdila, že PC2 bol riadený kontraktilnými a metabolickými podpismi (obrázok 2B a doplnkové obrázky 6D–E, doplnkové súbory údajov 5–6). Celkovo sa zistilo, že typ vlákien založený na MYH postačuje na vysvetlenie kontinuálnej variácie pozdĺž PC2, s výnimkou tzv. 2X vlákien, ktoré boli distribuované v celom transkriptóme v rámci rýchleho klastra.
A. Grafy analýzy hlavných komponentov (PCA) transkriptómových a proteómových súborov údajov, zafarbené podľa typu vlákna na základe MYH. B. Analýza obohatenia transkriptových a proteínových ovládačov v PC2 a PC1. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou balíka clusterProfiler a p-hodnôt upravených podľa Benjaminiho-Hochberga. C, D. PCA grafy zafarbené podľa termínov ontológie génov (GO) medzibunkovej adhézie v transkriptóme a termínov GO kostamery v proteóme. Šípky predstavujú transkriptové a proteínové ovládače a ich smery. E, F. Grafy aproximácie a projekcie jednotného manifoldu (UMAP) zobrazujú klinicky relevantné znaky zobrazujúce gradienty expresie nezávislé od typu pomalého/rýchleho vlákna. G, H. Korelácie medzi ovládačmi PC2 a PC1 v transkriptómoch a proteómoch.
Neočakávane, typ myofibríl založený na MYH vysvetlil iba druhý najvyšší stupeň variability (PC2), čo naznačuje, že iné biologické faktory nesúvisiace s typom myofibríl založeným na MYH (PC1) hrajú dôležitú úlohu v regulácii heterogenity vlákien kostrového svalstva. Analýza nadmerného zastúpenia najdôležitejších faktorov v PC1 odhalila, že variabilita v PC1 bola primárne určená adhéziou buniek a obsahom ribozómov v transkriptóme a kostamerami a ribozomálnymi proteínmi v proteóme (obrázok 2B a doplnkové obrázky 6D–E, doplnková sada údajov 7). V kostrovom svale kostamery spájajú Z-disk so sarkolemou a podieľajú sa na prenose sily a signalizácii. 25 Anotované PCA grafy s použitím znakov adhézie buniek (transkriptóm, obrázok 2C) a kostamery (proteóm, obrázok 2D) odhalili silný posun doľava v PC1, čo naznačuje, že tieto znaky sú obohatené o určité vlákna.
Podrobnejšie skúmanie zhlukovania myofibríl na úrovni UMAP odhalilo, že väčšina znakov vykazovala expresný gradient založený na MYH, ktorý je nezávislý od typu myofibríl, a nie špecifický pre jednotlivé subklastre myofibríl. Táto kontinuita bola pozorovaná u niekoľkých génov spojených s patologickými stavmi (obrázok 2E), ako napríklad CHCHD10 (neuromuskulárne ochorenie), SLIT3 (svalová atrofia), CTDNEP1 (svalové ochorenie). Táto kontinuita bola pozorovaná aj v celom proteóme, vrátane proteínov spojených s neurologickými poruchami (UGDH), inzulínovou signalizáciou (PHIP) a transkripciou (HIST1H2AB) (obrázok 2F). Tieto údaje spoločne naznačujú kontinuitu v heterogenite pomalých/rýchlych zášklbov nezávislej od typu vlákien naprieč rôznymi myofibrilami.
Je zaujímavé, že riadiace gény v PC2 vykazovali dobrú koreláciu transkriptóm-proteóm (r = 0,663) (obrázok 2G), čo naznačuje, že typy vlákien s pomalým a rýchlym zášklbom, a najmä kontraktilné a metabolické vlastnosti vlákien kostrového svalstva, sú transkripčne regulované. Riadiace gény v PC1 však nevykazovali žiadnu koreláciu transkriptóm-proteóm (r = -0,027) (obrázok 2H), čo naznačuje, že variácie nesúvisiace s typmi vlákien s pomalým/rýchlym zášklbom sú do značnej miery regulované posttranskripčne. Keďže variácie v PC1 boli primárne vysvetlené termínmi ontológie ribozomálnych génov a vzhľadom na to, že ribozómy hrajú v bunke kľúčovú a špecializovanú úlohu tým, že sa aktívne podieľajú na translácii proteínov a ovplyvňujú ju,31 sme sa ďalej vydali na skúmanie tejto neočakávanej heterogenity ribozómov.
Najprv sme zafarbili graf analýzy hlavných komponentov proteomiky podľa relatívneho zastúpenia proteínov v termíne GOCC „cytoplazmatický ribozóm“ (obrázok 3A). Hoci je tento termín obohatený na pozitívnej strane PC1, čo vedie k malému gradientu, ribozomálne proteíny riadia rozdelenie v oboch smeroch PC1 (obrázok 3A). Ribozomálne proteíny obohatené na negatívnej strane PC1 zahŕňali RPL18, RPS18 a RPS13 (obrázok 3B), zatiaľ čo RPL31, RPL35 a RPL38 (obrázok 3C) boli hlavnými faktormi na pozitívnej strane PC1. Je zaujímavé, že RPL38 a RPS13 boli vysoko exprimované v kostrovom svale v porovnaní s inými tkanivami (doplnkový obrázok 7A). Tieto charakteristické ribozomálne podpisy v PC1 neboli pozorované v transkriptóme (doplnkový obrázok 7B), čo naznačuje posttranskripčnú reguláciu.
A. Graf analýzy hlavných komponentov (PCA) zafarbený podľa termínov cytoplazmatickej ribozomálnej génovej ontológie (GO) v proteóme. Šípky označujú smer proteínom sprostredkovanej variácie v grafe PCA. Dĺžka čiary zodpovedá skóre hlavnej zložky pre daný proteín. B, C. Grafy charakteristík PCA pre RPS13 a RPL38. D. Nekontrolovaná hierarchická zhlukovacia analýza cytoplazmatických ribozomálnych proteínov. E. Štrukturálny model ribozómu 80S (PDB: 4V6X) zvýrazňujúci ribozomálne proteíny s rôznym zastúpením vo vláknach kostrového svalstva. F. Ribozomálne proteíny s rôznou stechiometriou lokalizované v blízkosti výstupného kanála mRNA.
Koncepty heterogenity a špecializácie ribozómov boli navrhnuté už skôr, pričom prítomnosť odlišných subpopulácií ribozómov (heterogenita ribozómov) môže priamo ovplyvniť transláciu proteínov v rôznych tkanivách32 a bunkách33 prostredníctvom selektívnej translácie špecifických súborov transkriptov mRNA34 (špecializácia ribozómov). Na identifikáciu subpopulácií ribozomálnych proteínov koexprimovaných vo vláknach kostrového svalstva sme vykonali nekontrolovanú hierarchickú zhlukovaciu analýzu ribozomálnych proteínov v proteóme (obrázok 3D, doplnková sada údajov 8). Ako sa očakávalo, ribozomálne proteíny sa nezhlukovali podľa typu vlákien na základe MYH. Identifikovali sme však tri odlišné zhluky ribozomálnych proteínov; prvý zhluk (ribozomálny_zhluk_1) je koregulovaný s RPL38, a preto má zvýšenú expresiu vo vláknach s pozitívnym profilom PC1. Druhý zhluk (ribozomálny_zhluk_2) je koregulovaný s RPS13 a je zvýšený vo vláknach s negatívnym profilom PC1. Tretí zhluk (ribozomálny_zhluk_3) nevykazuje koordinovanú diferenciálnu expresiu vo vláknach kostrového svalstva a možno ho považovať za „jadrový“ ribozomálny proteín kostrového svalstva. Oba ribozomálne zhluky 1 a 2 obsahujú ribozomálne proteíny, o ktorých sa predtým preukázalo, že regulujú alternatívnu transláciu (napr. RPL10A, RPL38, RPS19 a RPS25) a funkčne ovplyvňujú vývoj (napr. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 V súlade s výsledkami PCA pozorovaná heterogénna reprezentácia týchto ribozomálnych proteínov naprieč vláknami tiež vykazovala kontinuitu (doplnkový obrázok 7C).
Na vizualizáciu umiestnenia heterogénnych ribozomálnych proteínov v ribozóme sme použili štrukturálny model ľudského 80S ribozómu (Protein Data Bank: 4V6X) (obrázok 3E). Po izolácii ribozomálnych proteínov patriacich do rôznych ribozomálnych zhlukov neboli ich umiestnenia úzko zarovnané, čo naznačuje, že náš prístup nedokázal zabezpečiť obohatenie určitých oblastí/frakcií ribozómu. Je však zaujímavé, že podiel veľkých podjednotkových proteínov v zhluku 2 bol nižší ako v zhlukoch 1 a 3 (doplnkový obrázok 7D). Pozorovali sme, že proteíny so zmenenou stechiometriou vo vláknach kostrového svalstva boli prevažne lokalizované na povrchu ribozómu (obrázok 3E), čo je v súlade s ich schopnosťou interagovať s prvkami vnútorného vstupného miesta ribozómu (IRES) v rôznych populáciách mRNA, čím koordinovali selektívnu transláciu. 40, 41 Okrem toho sa mnoho proteínov so zmenenou stechiometriou vo vláknach kostrového svalstva nachádzalo v blízkosti funkčných oblastí, ako je výstupný tunel mRNA (obrázok 3F), ktoré selektívne regulujú translačné predĺženie a zastavenie špecifických peptidov. 42 Stručne povedané, naše údaje naznačujú, že stechiometria ribozomálnych proteínov kostrového svalstva vykazuje heterogenitu, čo vedie k rozdielom medzi vláknami kostrového svalstva.
Ďalej sme sa zamerali na identifikáciu charakteristických znakov rýchlych a pomalých vlákien a preskúmanie mechanizmov ich transkripčnej regulácie. Porovnaním zhlukov rýchlych a pomalých vlákien definovaných pomocou UMAP v dvoch súboroch údajov (obrázky 1G–H a 4A–B) transkriptomické a proteomické analýzy identifikovali 1366 a 804 rozdielne sa vyskytujúcich znakov (obrázky 4A–B, doplnkové súbory údajov 9–12). Pozorovali sme očakávané rozdiely v charakteristických znakoch súvisiacich so sarkomérami (napr. tropomyozín a troponín), väzbou excitácie a kontrakcie (izoformy SERCA) a energetickým metabolizmom (napr. ALDOA a CKB). Okrem toho boli transkripty a proteíny regulujúce ubikvitináciu proteínov diferencovane exprimované v rýchlych a pomalých vláknach (napr. USP54, SH3RF2, USP28 a USP48) (obrázky 4A–B). Okrem toho, gén mikrobiálneho proteínu RP11-451G4.2 (DWORF), o ktorom sa predtým preukázalo, že je diferencovane exprimovaný naprieč typmi svalových vlákien jahňacieho mäsa43 a zvyšuje aktivitu SERCA v srdcovom svale44, bol významne upregulovaný v pomalých kostrových svalových vláknach (obrázok 4A). Podobne, na úrovni jednotlivých vlákien, boli pozorované významné rozdiely v známych podpisoch, ako sú izoformy laktátdehydrogenázy súvisiace s metabolizmom (LDHA a LDHB, obrázok 4C a doplnkový obrázok 8A)45,46, ako aj predtým neznáme podpisy špecifické pre typ vlákien (ako napríklad IRX3, USP54, USP28 a DPYSL3) (obrázok 4C). Medzi transkriptomickými a proteomickými súbormi údajov došlo k významnému prekrývaniu diferencovane exprimovaných znakov (doplnkový obrázok 8B), ako aj k násobnej korelácii zmien spôsobenej najmä výraznejšou diferenciálnou expresiou sarkomérnych znakov (doplnkový obrázok 8C). Je pozoruhodné, že niektoré signatúry (napr. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) vykazovali silnú posttranskripčnú reguláciu iba na proteomickej úrovni a mali expresné profily špecifické pre typ pomalých/rýchlych zášklbov (doplnkový obrázok 8C).
A a B sopkové grafy porovnávajúce pomalé a rýchle zhluky identifikované grafmi uniform manifold approximation and projection (UMAP) na obrázkoch 1G–H. Farebné bodky predstavujú transkripty alebo proteíny, ktoré sa významne líšia pri FDR < 0,05, a tmavšie bodky predstavujú transkripty alebo proteíny, ktoré sa významne líšia pri logaritmickej zmene > 1. Obojsmerná štatistická analýza sa vykonala pomocou Waldovho testu DESeq2 s p-hodnotami upravenými Benjaminiho-Hochbergom (transkriptomika) alebo metódou lineárneho modelu Limma s empirickou Bayesovskou analýzou, po ktorej nasledovala Benjaminiho-Hochbergova úprava pre viacnásobné porovnania (proteomika). C Signatúrne grafy vybraných diferencovane exprimovaných génov alebo proteínov medzi pomalými a rýchlymi vláknami. D Analýza obohatenia významne diferencovane exprimovaných transkriptov a proteínov. Prekrývajúce sa hodnoty sú obohatené v oboch súboroch údajov, transkriptómové hodnoty sú obohatené iba v transkriptóme a proteómové hodnoty sú obohatené iba v proteóme. Štatistická analýza sa vykonala pomocou balíka clusterProfiler s p-hodnotami upravenými Benjaminiho-Hochbergom. E. Transkripčné faktory špecifické pre typ vlákien identifikované SCENIC na základe skóre špecifickosti regulátorov odvodených zo SCENIC a rozdielnej expresie mRNA medzi typmi vlákien. F. Profilovanie vybraných transkripčných faktorov diferencovane exprimovaných medzi pomalými a rýchlymi vláknami.
Následne sme vykonali analýzu nadmerného zastúpenia diferencovane zastúpených génov a proteínov (obrázok 4D, doplnkový súbor údajov 13). Obohatenie dráhy o znaky, ktoré sa medzi týmito dvoma súbormi údajov líšili, odhalilo očakávané rozdiely, ako sú procesy β-oxidácie mastných kyselín a metabolizmu ketónov (pomalé vlákna), kontrakcia myofilamentov/svalov (rýchle a pomalé vlákna) a katabolické procesy sacharidov (rýchle vlákna). Aktivita serín/treonín proteínfosfatázy bola tiež zvýšená v rýchlych vláknach, čo bolo spôsobené znakmi, ako sú regulačné a katalytické podjednotky fosfatázy (PPP3CB, PPP1R3D a PPP1R3A), o ktorých je známe, že regulujú metabolizmus glykogénu (47) (doplnkové obrázky 8D–E). Medzi ďalšie dráhy obohatené o rýchle vlákna patrili processingové (P-) telieska (YTHDF3, TRIM21, LSM2) v proteóme (doplnkový obrázok 8F), potenciálne zapojené do posttranskripčnej regulácie (48), a aktivita transkripčných faktorov (SREBF1, RXRG, RORA) v transkriptóme (doplnkový obrázok 8G). Pomalé vlákna boli obohatené o oxidoreduktázovú aktivitu (BDH1, DCXR, TXN2) (doplnkový obrázok 8H), väzbu amidov (CPTP, PFDN2, CRYAB) (doplnkový obrázok 8I), extracelulárnu matricu (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (doplnkový obrázok 8J) a aktivitu receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (doplnkový obrázok 8K).
Aby sme získali hlbší prehľad o transkripčnej regulácii, ktorá je základom charakteristík typu pomalých/rýchlych svalových vlákien, vykonali sme analýzu obohatenia transkripčných faktorov pomocou SCENIC49 (doplnkový súbor údajov 14). Mnohé transkripčné faktory boli významne obohatené medzi rýchlymi a pomalými svalovými vláknami (obrázok 4E). Patrili sem transkripčné faktory, ako napríklad MAFA, ktorý bol predtým spájaný s vývojom rýchlych svalových vlákien,50 ako aj niekoľko transkripčných faktorov, ktoré predtým neboli spojené s génovými programami špecifickými pre typ svalových vlákien. Medzi nimi boli PITX1, EGR1 a MYF6 najviac obohatené transkripčné faktory v rýchlych svalových vláknach (obrázok 4E). Naproti tomu ZSCAN30 a EPAS1 (tiež známy ako HIF2A) boli najviac obohatené transkripčné faktory v pomalých svalových vláknach (obrázok 4E). V súlade s tým bol MAFA exprimovaný vo vyšších hladinách v oblasti UMAP zodpovedajúcej rýchlym svalovým vláknam, zatiaľ čo EPAS1 mal opačný expresný vzorec (obrázok 4F).
Okrem známych génov kódujúcich proteíny existuje množstvo nekódujúcich RNA biotypov, ktoré môžu byť zapojené do regulácie ľudského vývoja a ochorení. 51, 52 V transkriptómových súboroch údajov vykazuje niekoľko nekódujúcich RNA špecifickosť pre typ vlákien (obrázok 5A a doplnkový súbor údajov 15), vrátane LINC01405, ktorá je vysoko špecifická pre pomalé vlákna a u pacientov s mitochondriálnou myopatiou je hlásená jej znížená hladina vo svaloch. 53 Naproti tomu RP11-255P5.3, zodpovedajúci génu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, vykazuje špecifickosť pre typ rýchleho vlákna. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) aj RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) vykazujú špecifickosť pre kostrové svalstvo (doplnkové obrázky 9A–B) a nemajú žiadne známe kontraktilné gény v rámci svojho 1 Mb genomického okolia, čo naznačuje, že hrajú špecializovanú úlohu v regulácii typov vlákien, a nie v regulácii susedných kontraktilných génov. Profily expresie špecifické pre pomalé/rýchle typy vlákien LINC01405 a RP11-255P5.3 boli potvrdené pomocou RNAscope (obrázky 5B–C).
A. Nekódujúce RNA transkripty sú významne regulované v pomalých a rýchlych svalových vláknach. B. Reprezentatívne snímky RNAscope znázorňujúce špecifickosť pomalých a rýchlych svalových vlákien LINC01405 a RP11-255P5.3. Mierka = 50 μm. C. Kvantifikácia expresie nekódujúcej RNA špecifickej pre typ myofibríl, stanovená pomocou RNAscope (n = 3 biopsie od nezávislých jedincov, porovnávajúce rýchle a pomalé svalové vlákna v rámci každého jedinca). Štatistická analýza sa vykonala pomocou obojstranného Studentovho t-testu. Krabicové grafy zobrazujú medián a prvý a tretí kvartil, pričom fúzy ukazujú na minimálne a maximálne hodnoty. D. Pracovný postup identifikácie mikrobiálnych proteínov de novo (vytvorený pomocou BioRender.com). E. Mikrobiálny proteín LINC01405_ORF408:17441:17358 je špecificky exprimovaný v pomalých kostrových svalových vláknach (n = 5 biopsií od nezávislých účastníkov, porovnávajúcich rýchle a pomalé svalové vlákna v rámci každého účastníka). Štatistická analýza sa vykonala s použitím Limmovej lineárnej modelovej metódy v kombinácii s empirickým Bayesovským prístupom, po ktorom nasledovala Benjaminiho-Hochbergova metóda pre viacnásobné porovnania s úpravou p-hodnoty. Krabicové grafy zobrazujú medián, prvý a tretí kvartil, pričom fúzy smerujú k maximálnym/minimálnym hodnotám.
Nedávne štúdie ukázali, že mnoho predpokladaných nekódujúcich transkriptov kóduje transkribované mikrobiálne proteíny, z ktorých niektoré regulujú funkciu svalov. 44, 55 Aby sme identifikovali mikrobiálne proteíny s potenciálnou špecifickosťou pre typ vlákien, prehľadali sme náš súbor údajov o 1000 proteómoch vlákien pomocou vlastného súboru FASTA obsahujúceho sekvencie nekódujúcich transkriptov (n = 305) nájdených v súbore údajov o 1000 transkriptómoch vlákien (obrázok 5D). Identifikovali sme 197 mikrobiálnych proteínov z 22 rôznych transkriptov, z ktorých 71 bolo diferencovane regulovaných medzi pomalými a rýchlymi vláknami kostrového svalstva (doplnkový obrázok 9C a doplnkový súbor údajov 16). Pre LINC01405 boli identifikované tri produkty mikrobiálnych proteínov, z ktorých jeden vykazoval podobnú špecifickosť pre pomalé vlákna ako jeho transkript (obrázok 5E a doplnkový obrázok 9D). Preto sme identifikovali LINC01405 ako gén kódujúci mikrobiálny proteín špecifický pre pomalé vlákna kostrového svalstva.
Vyvinuli sme komplexný pracovný postup pre rozsiahlu proteomickú charakterizáciu jednotlivých svalových vlákien a identifikovali sme regulátory heterogenity vlákien v zdravých stavoch. Tento pracovný postup sme aplikovali na pochopenie toho, ako nemalínové myopatie ovplyvňujú heterogenitu vlákien kostrového svalstva. Nemalínové myopatie sú dedičné svalové ochorenia, ktoré spôsobujú svalovú slabosť a u postihnutých detí sa prejavujú celým radom komplikácií vrátane respiračných ťažkostí, skoliózy a obmedzenej pohyblivosti končatín. 19,20 Pri nemalínových myopatiách typicky vedú patogénne varianty v génoch, ako je aktín alfa 1 (ACTA1), k prevahe zloženia pomaly sa sťahujúcich myofibríl, hoci tento účinok je heterogénny. Jednou z významných výnimiek je troponín T1 nemalínová myopatia (TNNT1), ktorá má prevahu rýchlych vlákien. Lepšie pochopenie heterogenity, ktorá je základom dysregulácie vlákien kostrového svalstva pozorovanej pri nemalínových myopatiách, môže teda pomôcť odhaliť komplexný vzťah medzi týmito ochoreniami a typom myofibríl.
V porovnaní so zdravými kontrolami (n=3 na skupinu) vykazovali myofibrily izolované od pacientov s nemalínovou myopatiou s mutáciami v génoch ACTA1 a TNNT1 výraznú atrofiu alebo dystrofiu myofibrily (obrázok 6A, doplnková tabuľka 3). To predstavovalo značné technické výzvy pre proteomickú analýzu kvôli obmedzenému množstvu dostupného materiálu. Napriek tomu sme boli schopní detegovať 2485 proteínov v 272 kostrových myofibrilách. Po filtrácii najmenej 1000 kvantifikovaných proteínov na vlákno bolo 250 vlákien podrobených následnej bioinformatickej analýze. Po filtrácii bolo kvantifikovaných v priemere 1573 ± 359 proteínov na vlákno (doplnkový obrázok 10A, doplnkové súbory údajov 17–18). Je pozoruhodné, že napriek významnému zníženiu veľkosti vlákien bola hĺbka proteómu vzoriek pacientov s nemalínovou myopatiou len mierne znížená. Okrem toho, spracovanie týchto údajov pomocou našich vlastných súborov FASTA (vrátane nekódujúcich transkriptov) nám umožnilo identifikovať päť mikrobiálnych proteínov v kostrových myofibrách pacientov s nemalínovou myopatiou (doplnkový súbor údajov 19). Dynamický rozsah proteómu bol výrazne širší a celkové proteíny v kontrolnej skupine dobre korelovali s výsledkami predchádzajúcej analýzy 1000-vláknového proteómu (doplnkový obrázok 10B–C).
A. Mikroskopické snímky znázorňujúce atrofiu alebo dystrofiu vlákien a prevahu rôznych typov vlákien na základe MYH u nemalínových myopatií (NM) ACTA1 a TNNT1. Mierka = 100 μm. Aby sa zabezpečila reprodukovateľnosť farbenia u pacientov s ACTA1 a TNNT1, tri biopsie pacientov boli zafarbené dva až trikrát (štyri rezy na prípad) pred výberom reprezentatívnych snímok. B. Pomery typov vlákien u účastníkov na základe MYH. C. Graf analýzy hlavných komponentov (PCA) vlákien kostrového svalstva u pacientov s nemalínovými myopatiami a kontrolnej skupiny. D. Vlákna kostrového svalstva od pacientov s nemalínovými myopatiami a kontrolnej skupiny premietané na graf PCA určený z 1000 analyzovaných vlákien na obrázku 2. Napríklad, sopečné grafy porovnávajúce rozdiely medzi účastníkmi s nemalínovými myopatiami ACTA1 a TNNT1 a kontrolnou skupinou a medzi účastníkmi s nemalínovými myopatiami ACTA1 a TNNT1. Farebné krúžky označujú proteíny, ktoré sa významne líšili pri π < 0,05, a tmavé bodky označujú proteíny, ktoré sa významne líšili pri FDR < 0,05. Štatistická analýza sa vykonala s použitím metódy lineárneho modelu Limma a empirických Bayesovských metód, po ktorej nasledovala úprava p-hodnoty pre viacnásobné porovnania s použitím metódy Benjaminiho-Hochberga. H. Analýza obohatenia významne diferencovane exprimovaných proteínov v celom proteóme a vo vláknach typu 1 a 2A. Štatistická analýza sa vykonala s použitím balíka clusterProfiler a p-hodnôt upravených Benjaminiho-Hochbergom. I, J. Grafy analýzy hlavných komponentov (PCA) zafarbené termínmi extracelulárnej matrice a mitochondriálnej génovej ontológie (GO).
Keďže nemalínové myopatie môžu ovplyvniť podiel typov myofibríl exprimujúcich MYH v kostrovom svale,19,20 najprv sme skúmali typy myofibríl exprimujúcich MYH u pacientov s nemalínovými myopatiami a kontrolnou skupinou. Typ myofibríl sme určili pomocou nestrannej metódy, ktorá bola predtým opísaná pre test 1000 myofibríl (doplnkové obrázky 10D–E), a opäť sa nám nepodarilo identifikovať čisté 2X myofibry (obrázok 6B). Pozorovali sme heterogénny vplyv nemalínových myopatií na typ myofibríl, pretože dvaja pacienti s mutáciami ACTA1 mali zvýšený podiel myofibríl typu 1, zatiaľ čo dvaja pacienti s nemalínovou myopatiou TNNT1 mali znížený podiel myofibríl typu 1 (obrázok 6B). Expresia MYH2 a izoforiem rýchlych troponínov (TNNC2, TNNI2 a TNNT3) bola skutočne znížená pri ACTA1-nemalínových myopatiách, zatiaľ čo expresia MYH7 bola znížená pri TNNT1-nemalínových myopatiách (doplnkový obrázok 11A). To je v súlade s predchádzajúcimi správami o heterogénnej zmene typu myofibríl pri nemalínových myopatiách.19,20 Tieto výsledky sme potvrdili imunohistochemicky a zistili sme, že pacienti s ACTA1-nemalínovou myopatiou mali prevahu myofibríl typu 1, zatiaľ čo pacienti s TNNT1-nemalínovou myopatiou mali opačný vzorec (obrázok 6A).
Na úrovni jednovláknového proteómu sa vlákna kostrového svalstva od pacientov s nemalínovou myopatiou ACTA1 a TNNT1 zhlukovali s väčšinou kontrolných vlákien, pričom vlákna s nemalínovou myopatiou TNNT1 boli vo všeobecnosti najviac postihnuté (obrázok 6C). Toto bolo obzvlášť zrejmé pri vykresľovaní grafov pseudoinflovaných vlákien pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA) pre každého pacienta, pričom pacienti s nemalínovou myopatiou TNNT1 2 a 3 sa javili ako najviac vzdialení od kontrolných vzoriek (doplnkový obrázok 11B, doplnkový súbor údajov 20). Aby sme lepšie pochopili, ako sa vlákna od pacientov s myopatiou porovnávajú so zdravými vláknami, použili sme podrobné informácie získané z proteomickej analýzy 1 000 vlákien od zdravých dospelých účastníkov. Vlákna zo súboru údajov o myopatii (pacienti s nemalínovou myopatiou ACTA1 a TNNT1 a kontrolná skupina) sme premietli do grafu PCA získaného z proteomickej analýzy 1000 vlákien (obrázok 6D). Rozloženie typov vlákien MYH pozdĺž PC2 v kontrolných vláknach bolo podobné rozloženiu vlákien získanému z proteomickej analýzy 1000 vlákien. Väčšina vlákien u pacientov s nemalínovou myopatiou sa však posunula smerom nadol v oblasti PC2, pričom sa prekrývala so zdravými rýchlo sa sťahujúcimi vláknami, bez ohľadu na ich natívny typ vlákien MYH. Hoci teda pacienti s nemalínovou myopatiou ACTA1 vykazovali posun smerom k vláknam typu 1 pri kvantifikácii pomocou metód založených na MYH, tak nemalínová myopatia ACTA1, ako aj nemalínová myopatia TNNT1, posunuli proteóm vlákien kostrového svalstva smerom k rýchlo sa sťahujúcim vláknam.
Následne sme priamo porovnali každú skupinu pacientov so zdravými kontrolami a identifikovali sme 256 a 552 diferencovane exprimovaných proteínov u nemalínových myopatií ACTA1 a TNNT1 (obrázok 6E–G a doplnkový obrázok 11C, doplnkový súbor údajov 21). Analýza obohatenia génov odhalila koordinovaný pokles mitochondriálnych proteínov (obrázok 6H–I, doplnkový súbor údajov 22). Prekvapivo, napriek diferenciálnej prevahe typov vlákien u nemalínových myopatií ACTA1 a TNNT1, bol tento pokles úplne nezávislý od typu vlákien založeného na MYH (obrázok 6H a doplnkové obrázky 11D–I, doplnkový súbor údajov 23). U nemalínových myopatií ACTA1 alebo TNNT1 boli regulované aj tri mikrobiálne proteíny. Dva z týchto mikroproteínov, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (tiež známy ako LINC00598 alebo Lnc-FOXO1) a ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), vykazovali rozdielnu abundanciu iba v myofibrách typu 1. Bolo predtým hlásené, že ENSG00000215483_TR14_ORF67 zohráva úlohu v regulácii bunkového cyklu.56 Na druhej strane, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (zodpovedajúci LINC01798) bol zvýšený v myofibrách typu 1 aj typu 2A pri ACTA1-nemalínovej myopatii v porovnaní so zdravými kontrolami (doplnkový obrázok 12A, doplnkový súbor údajov 24). Naproti tomu ribozomálne proteíny neboli nemalínovou myopatiou do značnej miery ovplyvnené, hoci RPS17 bol pri nemalínovej myopatii ACTA1 downregulovaný (Obr. 6E).
Analýza obohatenia tiež odhalila zvýšenú reguláciu procesov imunitného systému pri nemalínových myopatiách ACTA1 a TNNT1, zatiaľ čo bunková adhézia bola tiež zvýšená pri nemalínovej myopatii TNNT1 (obrázok 6H). Obohatenie týchto extracelulárnych faktorov sa prejavilo posunom extracelulárnych matrixových proteínov PCA v PC1 a PC2 negatívnym smerom (t. j. smerom k najviac postihnutým vláknam) (obrázok 6J). Obe skupiny pacientov vykazovali zvýšenú expresiu extracelulárnych proteínov zapojených do imunitných odpovedí a mechanizmov opravy sarkolémy, ako sú anexíny (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 a ich interagujúci proteín S100A1159 (doplnkové obrázky 12B–C). Tento proces bol predtým hlásený ako zvýšený pri svalových dystrofiách60, ale podľa našich vedomostí nebol doteraz spájaný s nemalínovými myopatiami. Normálna funkcia tohto molekulárneho aparátu je potrebná na opravu sarkolémy po poranení a na fúziu novovytvorených myocytov s myofibrilami58,61. Zvýšená aktivita tohto procesu v oboch skupinách pacientov teda naznačuje reparatívnu reakciu na poškodenie spôsobené nestabilitou myofibríl.
Účinky každej nemalínovej myopatie boli dobre korelované (r = 0,736) a vykazovali primerané prekrývanie (doplnkové obrázky 11A–B), čo naznačuje, že nemalínová myopatia ACTA1 a TNNT1 majú podobné účinky na proteóm. Niektoré proteíny však boli regulované iba pri nemalínovej myopatii ACTA1 alebo TNNT1 (doplnkové obrázky 11A a C). Profibrotický proteín MFAP4 bol jedným z najviac upregulovaných proteínov pri nemalínovej myopatii TNNT1, ale pri nemalínovej myopatii ACTA1 zostal nezmenený. SKIC8, zložka komplexu PAF1C zodpovedná za reguláciu transkripcie génu HOX, bola downregulovaná pri nemalínovej myopatii TNNT1, ale nebola ovplyvnená pri nemalínovej myopatii ACTA1 (doplnkový obrázok 11A). Priame porovnanie nemalínovej myopatie ACTA1 a TNNT1 odhalilo väčšie zníženie mitochondriálnych proteínov a zvýšenie proteínov imunitného systému pri nemalínovej myopatii TNNT1 (obrázok 6G–H a doplnkové obrázky 11C a 11H–I). Tieto údaje sú v súlade s väčšou atrofiou/dystrofiou pozorovanou pri nemalínovej myopatii TNNT1 v porovnaní s nemalínovou myopatiou TNNT1 (obrázok 6A), čo naznačuje, že nemalínová myopatia TNNT1 predstavuje závažnejšiu formu ochorenia.
Aby sme posúdili, či pozorované účinky nemalínovej myopatie pretrvávajú na úrovni celého svalu, vykonali sme hromadnú proteomickú analýzu svalových biopsií z tej istej kohorty pacientov s nemalínovou myopatiou TNNT1 a porovnali sme ich s kontrolnou skupinou (n=3 na skupinu) (doplnkový obrázok 13A, doplnkový súbor údajov 25). Ako sa očakávalo, kontrolná skupina si bola v analýze hlavných komponentov úzko prepojená, zatiaľ čo pacienti s nemalínovou myopatiou TNNT1 vykazovali vyššiu variabilitu medzi vzorkami, podobnú tej, ktorá sa pozorovala pri analýze jednotlivých vlákien (doplnkový obrázok 13B). Hromadná analýza reprodukovala diferencovane exprimované proteíny (doplnkový obrázok 13C, doplnkový súbor údajov 26) a biologické procesy (doplnkový obrázok 13D, doplnkový súbor údajov 27) zvýraznené porovnaním jednotlivých vlákien, ale stratila schopnosť rozlišovať medzi rôznymi typmi vlákien a nezohľadnila heterogénne účinky ochorenia naprieč vláknami.
Tieto údaje spoločne ukazujú, že proteomika jednotlivých myofibríl dokáže objasniť klinické biologické znaky, ktoré nie je možné zistiť cielenými metódami, ako je imunoblotting. Tieto údaje navyše zdôrazňujú obmedzenia použitia samotného testovania aktínových vlákien (MYH) na opis fenotypovej adaptácie. Hoci sa prepínanie typov vlákien medzi aktínovými a troponínovými nemalínovými myopatiami líši, obe nemalínové myopatie oddeľujú testovanie MYH vlákien od metabolizmu vlákien kostrového svalstva smerom k rýchlejšiemu a menej oxidačnému svalovému proteómu.
Bunková heterogenita je kritická pre to, aby tkanivá spĺňali svoje rozmanité požiadavky. V kostrovom svale sa to často opisuje ako typy vlákien charakterizované rôznym stupňom produkcie sily a únavy. Je však zrejmé, že to vysvetľuje len malú časť variability vlákien kostrového svalstva, ktorá je oveľa variabilnejšia, komplexnejšia a mnohostrannejšia, ako sa doteraz predpokladalo. Technologický pokrok teraz objasnil faktory regulujúce vlákna kostrového svalstva. Naše údaje skutočne naznačujú, že vlákna typu 2X nemusia byť samostatným podtypom vlákien kostrového svalstva. Okrem toho sme identifikovali metabolické proteíny, ribozomálne proteíny a bunkové proteíny ako hlavné determinanty heterogenity vlákien kostrového svalstva. Aplikáciou nášho proteomického pracovného postupu na vzorky pacientov s myopatiou nematód sme ďalej preukázali, že typizácia vlákien založená na MYH úplne neodráža heterogenitu kostrového svalstva, najmä ak je systém narušený. V skutočnosti, bez ohľadu na typ vlákien založených na MYH, myopatia nematód vedie k posunu smerom k rýchlejším a menej oxidačným vláknam.
Vlákna kostrového svalstva sa klasifikujú od 19. storočia. Nedávne omické analýzy nám umožnili začať chápať expresné profily rôznych typov vlákien MYH a ich reakcie na rôzne stimuly. Ako je tu opísané, omické prístupy majú tiež výhodu väčšej citlivosti pri kvantifikácii markerov typu vlákien ako tradičné metódy založené na protilátkach, bez toho, aby sa spoliehali na kvantifikáciu jedného (alebo niekoľkých) markerov na definovanie typu vlákien kostrového svalstva. Použili sme komplementárne transkriptomické a proteomické pracovné postupy a integrovali výsledky na preskúmanie transkripčnej a posttranskripčnej regulácie heterogenity vlákien vo vláknach ľudského kostrového svalstva. Tento pracovný postup viedol k neschopnosti identifikovať čisté vlákna typu 2X na úrovni proteínu v svale vastus lateralis našej kohorty zdravých mladých mužov. To je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami jednotlivých vlákien, ktoré zistili <1 % čistých 2X vlákien v zdravom svale vastus lateralis, hoci by sa to malo v budúcnosti potvrdiť aj v iných svaloch. Rozdiel medzi detekciou takmer čistých 2X vlákien na úrovni mRNA a iba zmiešaných 2A/2X vlákien na úrovni proteínu je záhadný. Expresia mRNA izoformy MYH nie je cirkadiánna,67 čo naznačuje, že je nepravdepodobné, že by sme „prehliadli“ signál začiatku MYH2 v zdanlivo čistých 2X vláknach na úrovni RNA. Jedným z možných vysvetlení, aj keď čisto hypotetických, by mohli byť rozdiely v stabilite proteínov a/alebo mRNA medzi izoformami MYH. V skutočnosti žiadne rýchle vlákno nie je 100 % čisté pre žiadnu izoformu MYH a nie je jasné, či by hladiny expresie mRNA MYH1 v rozsahu 70 – 90 % viedli k rovnakému zastúpeniu MYH1 a MYH2 na úrovni proteínov. Avšak pri zohľadnení celého transkriptómu alebo proteómu dokáže klastrová analýza s istotou identifikovať iba dva odlišné klastre predstavujúce pomalé a rýchle vlákna kostrového svalstva, bez ohľadu na ich presné zloženie MYH. To je v súlade s analýzami používajúcimi jednojadrové transkriptomické prístupy, ktoré typicky identifikujú iba dva odlišné myonukleárne klastre. 68, 69, 70 Okrem toho, hoci predchádzajúce proteomické štúdie identifikovali vlákna typu 2X, tieto vlákna sa nezhlukujú oddelene od zvyšku rýchlych vlákien a vykazujú len malý počet rozdielne hojných proteínov v porovnaní s inými typmi vlákien na základe MYH. 14 Tieto výsledky naznačujú, že by sme sa mali vrátiť k pohľadu na klasifikáciu svalových vlákien zo začiatku 20. storočia, ktorý rozdeľoval vlákna ľudského kostrového svalstva nie do troch odlišných tried na základe MYH, ale do dvoch zhlukov na základe ich metabolických a kontraktilných vlastností. 63
A čo je dôležitejšie, heterogenita myofibríl by sa mala posudzovať z viacerých hľadísk. Predchádzajúce „omické“ štúdie poukazovali týmto smerom a naznačovali, že vlákna kostrového svalstva netvoria samostatné zhluky, ale sú usporiadané pozdĺž kontinua. 11, 13, 14, 64, 71 Tu ukazujeme, že okrem rozdielov v kontraktilných a metabolických vlastnostiach kostrového svalstva sa myofibry dajú rozlíšiť aj podľa znakov súvisiacich s interakciami medzi bunkami a translačnými mechanizmami. V skutočnosti sme zistili heterogenitu ribozómov vo vláknach kostrového svalstva, ktorá prispieva k heterogenite nezávisle od typov pomalých a rýchlych vlákien. Základná príčina tejto podstatnej heterogenity myofibríl, nezávisle od typu pomalých a rýchlych vlákien, zostáva nejasná, ale môže poukazovať na špecializovanú priestorovú organizáciu vo svalových zväzkoch, ktoré optimálne reagujú na špecifické sily a zaťaženia,72 špecializovanú bunkovú alebo orgánovo špecifickú komunikáciu s inými typmi buniek vo svalovom mikroprostredí73,74,75 alebo rozdiely v aktivite ribozómov v rámci jednotlivých myofibríl. V skutočnosti sa ukázalo, že ribozomálna heteroplazmia, buď prostredníctvom paralogickej substitúcie RPL3 a RPL3L, alebo na úrovni 2'O-metylácie rRNA, je spojená s hypertrofiou kostrového svalstva76,77. Multiomické a priestorové aplikácie v kombinácii s funkčnou charakterizáciou jednotlivých svalových vlákien ďalej prehĺbia naše chápanie svalovej biológie na multiomickej úrovni78.
Analýzou proteómov jednotlivých myofibríl od pacientov s nemalínovými myopatiami sme tiež preukázali užitočnosť, účinnosť a aplikovateľnosť proteomiky jednotlivých myofibríl na objasnenie klinickej patofyziológie kostrového svalstva. Okrem toho, porovnaním nášho pracovného postupu s globálnou proteomickou analýzou sme dokázali, že proteomika jednotlivých myofibríl poskytuje rovnakú hĺbku informácií ako globálna tkanivová proteomika a rozširuje túto hĺbku zohľadnením heterogenity medzi vláknami a typu myofibríl. Okrem očakávaných (hoci variabilných) rozdielov v pomere typov vlákien pozorovaných pri nemalínových myopatiách ACTA1 a TNNT1 v porovnaní so zdravými kontrolami,19 sme tiež pozorovali oxidačnú a extracelulárnu remodeláciu nezávislú od prepínania typov vlákien sprostredkovaného MYH. Fibróza bola už predtým hlásená pri TNNT1 nemalínových myopatiách.19 Naša analýza však nadväzuje na toto zistenie tým, že odhaľuje aj zvýšené hladiny extracelulárne sekretovaných proteínov súvisiacich so stresom, ako sú anexíny, ktoré sa podieľajú na mechanizmoch opravy sarkolemy, v myofibrách pacientov s ACTA1 a TNNT1 nemalínovými myopatiami.57,58,59 Záverom možno povedať, že zvýšené hladiny anexínu v myofibrách pacientov s nemalínovou myopatiou môžu predstavovať bunkovú odpoveď na opravu ťažko atrofických myofibríl.
Hoci táto štúdia predstavuje doteraz najväčšiu analýzu celosvalovej omiky jednotlivých vlákien u ľudí, nie je bez obmedzení. Vlákna kostrového svalstva sme izolovali z relatívne malej a homogénnej vzorky účastníkov a jedného svalu (vastus lateralis). Preto nie je možné vylúčiť existenciu špecifických populácií vlákien naprieč typmi svalov a v extrémnych fázach svalovej fyziológie. Napríklad nemôžeme vylúčiť možnosť vzniku podskupiny ultrarýchlych vlákien (napr. čisté 2X vlákna) u vysoko trénovaných šprintérov a/alebo silových športovcov79 alebo počas období svalovej nečinnosti66,80. Okrem toho nám obmedzená veľkosť vzorky účastníkov zabránila v skúmaní pohlavných rozdielov v heterogenite vlákien, pretože je známe, že pomery typov vlákien sa medzi mužmi a ženami líšia. Okrem toho sme neboli schopní vykonať transkriptomické a proteomické analýzy na rovnakých svalových vláknach alebo vzorkách od rovnakých účastníkov. Keďže my a ďalší pokračujeme v optimalizácii analýz jednotlivých buniek a jednotlivých myofibríl pomocou omickej analýzy na dosiahnutie ultranízkeho vstupného množstva vzorky (ako je tu demonštrované v analýze vlákien od pacientov s mitochondriálnou myopatiou), stáva sa zrejmou možnosť kombinovať multi-omické (a funkčné) prístupy v rámci jednotlivých svalových vlákien.
Celkovo naše údaje identifikujú a vysvetľujú transkripčné a posttranskripčné faktory ovplyvňujúce heterogenitu kostrového svalstva. Konkrétne prezentujeme údaje, ktoré spochybňujú dlhotrvajúcu dogmu vo fyziológii kostrového svalstva spojenú s klasickou definíciou typov vlákien založenou na myotrofickom mentálnom hematológii (MYH). Dúfame, že obnovíme diskusiu a v konečnom dôsledku prehodnotíme naše chápanie klasifikácie a heterogenity vlákien kostrového svalstva.
Štrnásť belošských účastníkov (12 mužov a 2 ženy) dobrovoľne súhlasilo s účasťou na tejto štúdii. Štúdia bola schválená Etickou komisiou Univerzitnej nemocnice v Gente (BC-10237), bola v súlade s Helsinskou deklaráciou z roku 2013 a bola registrovaná na ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Všeobecné charakteristiky účastníkov sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1. Po získaní ústneho a písomného informovaného súhlasu sa účastníci pred konečným zaradením do štúdie podrobili lekárskemu vyšetreniu. Účastníci boli mladí (22 – 42 rokov), zdraví (bez zdravotných problémov, bez fajčenia v anamnéze) a mierne fyzicky aktívni. Maximálna spotreba kyslíka bola stanovená pomocou krokového ergometra na posúdenie fyzickej zdatnosti, ako bolo opísané vyššie. 81
Vzorky svalovej biopsie boli odobraté trikrát v pokoji a nalačno s odstupom 14 dní. Keďže tieto vzorky boli odobraté ako súčasť rozsiahlejšej štúdie, účastníci konzumovali placebo (laktózu), antagonistu H1-receptorov (540 mg fexofenadínu) alebo antagonistu H2-receptorov (40 mg famotidínu) 40 minút pred biopsiou. Predtým sme preukázali, že títo antagonisti histamínových receptorov neovplyvňujú pokojovú fyzickú zdatnosť kostrového svalstva81 a v našich grafoch kontroly kvality nebolo pozorované žiadne zhlukovanie súvisiace so stavom (doplnkové obrázky 3 a 6). Štandardizovaná diéta (41,4 kcal/kg telesnej hmotnosti, 5,1 g sacharidov/kg telesnej hmotnosti, 1,4 g bielkovín/kg telesnej hmotnosti a 1,6 g tuku/kg telesnej hmotnosti) bola udržiavaná 48 hodín pred každým experimentálnym dňom a štandardizované raňajky (1,5 g sacharidov/kg telesnej hmotnosti) boli konzumované ráno v experimentálny deň. V lokálnej anestézii (0,5 ml 1 % lidokaínu bez adrenalínu) boli odobraté svalové biopsie z m. vastus lateralis pomocou perkutánnej Bergströmovej aspirácie.82 Vzorky svalov boli okamžite zaliate do RNAlater a skladované pri teplote 4 °C až do manuálnej disekcie vlákien (až 3 dni).
Čerstvo izolované zväzky myofibríl boli prenesené do čerstvého média RNAlater v kultivačnej miske. Jednotlivé myofibrily boli potom manuálne rozrezané pomocou stereomikroskopu a jemnej pinzety. Z každej biopsie bolo vyrezaných dvadsaťpäť vlákien, pričom sa osobitná pozornosť venovala výberu vlákien z rôznych oblastí biopsie. Po rozrezaní bolo každé vlákno jemne ponorené do 3 μl lyzačného pufra (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) obsahujúceho enzýmy proteinázu K a DNázu, aby sa odstránili nežiaduce proteíny a DNA. Bunková lýza a odstránenie proteínov/DNA boli potom iniciované krátkym vortexovaním, odstreďovaním kvapaliny v mikrocentrifúge a inkubáciou pri izbovej teplote (10 min). Lyzát bol potom inkubovaný v termocykléri (T100, Bio-Rad) pri teplote 37 °C počas 5 minút, pri teplote 75 °C počas 5 minút a potom okamžite uskladnený pri teplote -80 °C až do ďalšieho spracovania.
Knižnice polyadenylovanej RNA kompatibilné s Illuminou boli pripravené z 2 µl lyzátu myofibríl pomocou súpravy QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Podrobné metódy možno nájsť v návode na použitie od výrobcu. Proces začína syntézou cDNA prvého vlákna reverznou transkripciou, počas ktorej sa zavádzajú jedinečné molekulárne identifikátory (UMI) a čiarové kódy i1 špecifické pre vzorku, aby sa zabezpečilo zlúčenie vzoriek a znížila technická variabilita počas následného spracovania. cDNA z 96 myofibríl sa potom zlúči a purifikuje magnetickými guľôčkami, po čom sa RNA odstráni a vykoná sa syntéza druhého vlákna pomocou náhodných primerov. Knižnica sa purifikuje magnetickými guľôčkami, pridajú sa značky i5/i7 špecifické pre daný pool a amplifikuje sa PCR. Posledný krok purifikácie vytvára knižnice kompatibilné s Illuminou. Kvalita každého poolu knižníc sa hodnotila pomocou súpravy High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na základe kvantifikácie Qubit boli súbory ďalej zlúčené v ekvimolárnych koncentráciách (2 nM). Výsledný súbor bol potom sekvenovaný na prístroji NovaSeq 6000 v štandardnom režime s použitím reagenčnej súpravy NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotidov) s koncentráciou 2 nM (4 % PhiX).
Náš proces je založený na procese analýzy dát QuantSeq Pool od Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Dáta boli najprv demultiplexované pomocou bcl2fastq2 (v2.20.0) na základe indexu i7/i5. Druhý čítací kód bol potom demultiplexovaný pomocou idemux (v0.1.6) na základe čiarového kódu vzorky i1 a sekvencie UMI boli extrahované pomocou umi_tools (v1.0.1). Čítania boli potom orezané pomocou cutadapt (v3.4) vo viacerých kolách, aby sa odstránili krátke čítania (dlhé <20) alebo čítania pozostávajúce výlučne z adaptorových sekvencií. Čítania boli potom zarovnané s ľudským genómom pomocou STAR (v2.6.0c) a súbory BAM boli indexované pomocou SAMtools (v1.11). Duplicitné čítania boli odstránené pomocou umi_tools (v1.0.1). Nakoniec bolo vykonané počítanie zarovnaní pomocou featureCounts v Subread (v2.0.3). Kontrola kvality sa vykonávala pomocou FastQC (v0.11.9) v niekoľkých medziľahlých fázach výroby.
Všetky ďalšie bioinformatické spracovania a vizualizácie boli vykonané v jazyku R (v4.2.3), primárne s použitím pracovného postupu Seurat (v4.4.0).83 Preto boli jednotlivé hodnoty UMI a matice metadát transformované do objektov Seurat. Gény exprimované v menej ako 30 % všetkých vlákien boli odstránené. Vzorky nízkej kvality boli odstránené na základe minimálnej prahovej hodnoty 1000 hodnôt UMI a 1000 detekovaných génov. Nakoniec 925 vlákien prešlo všetkými krokmi filtrovania kontroly kvality. Hodnoty UMI boli normalizované pomocou metódy Seurat SCTransform v2,84 vrátane všetkých 7418 detekovaných znakov a rozdiely medzi účastníkmi boli regresne odstránené. Všetky relevantné metadáta možno nájsť v doplnkovom súbore údajov 28.
Čas uverejnenia: 10. septembra 2025