Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Na dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame použiť novší prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer). Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu.
Vytvorenie zvieracích modelov modických zmien (MC) je dôležitým základom pre štúdium MC. Päťdesiatštyri novozélandských bielych králikov bolo rozdelených do skupiny s falošnou operáciou, do skupiny s implantáciou svalu (skupina ME) a do skupiny s implantáciou pulpózneho jadra (skupina NPE). V skupine NPE bola medzistavcová platnička obnažená anterolaterálnym lumbálnym chirurgickým prístupom a ihla bola použitá na prepichnutie tela stavca L5 v blízkosti koncovej platničky. NP bol extrahovaný z medzistavcovej platničky L1/2 injekčnou striekačkou a injikovaný do nej. Vŕtanie otvoru v subchondrálnej kosti. Chirurgické postupy a metódy vŕtania v skupine s implantáciou svalu a v skupine s falošnou operáciou boli rovnaké ako v skupine s implantáciou NP. V skupine ME bol do diery umiestnený kúsok svalu, zatiaľ čo v skupine s falošnou operáciou sa do diery nevložilo nič. Po operácii bolo vykonané MRI skenovanie a molekulárne biologické vyšetrenie. Signál v skupine NPE sa zmenil, ale v skupine s falošnou operáciou a v skupine ME nedošlo k žiadnej zjavnej zmene signálu. Histologické pozorovanie ukázalo, že abnormálna proliferácia tkaniva bola pozorovaná v mieste implantácie a expresia IL-4, IL-17 a IFN-y bola zvýšená v skupine NPE. Implantácia NP do subchondrálnej kosti môže vytvoriť zvierací model MC.
Modické zmeny (MC) sú lézie vertebrálnych koncových platničiek a priľahlej kostnej drene viditeľné na zobrazovaní magnetickou rezonanciou (MRI). Sú celkom bežné u jedincov s pridruženými symptómami1. Mnohé štúdie zdôraznili dôležitosť MC kvôli jej asociácii s bolesťou dolnej časti chrbta (LBP)2,3. de Roos et al.4 a Modic et al.5 nezávisle najprv opísali tri rôzne typy abnormalít subchondrálnych signálov v kostnej dreni stavcov. Modické zmeny typu I sú hypointenzívne na T1-vážených (T1W) sekvenciách a hyperintenzívne na T2-vážených (T2W) sekvenciách. Táto lézia odhaľuje fisúrne koncové platničky a priľahlé vaskulárne granulačné tkanivo v kostnej dreni. Modické zmeny typu II vykazujú vysoký signál na sekvenciách T1W aj T2W. Pri tomto type lézie možno nájsť deštrukciu koncových platničiek, ako aj histologickú tukovú náhradu susednej kostnej drene. Modické zmeny typu III vykazujú nízky signál v sekvenciách T1W a T2W. Boli pozorované sklerotické lézie zodpovedajúce koncovým platniam6. MC je považovaná za patologické ochorenie chrbtice a je úzko spojená s mnohými degeneratívnymi ochoreniami chrbtice7,8,9.
Vzhľadom na dostupné údaje niekoľko štúdií poskytlo podrobný pohľad na etiológiu a patologické mechanizmy MC. Albert a spol. naznačil, že MC môže byť spôsobená herniou disku8. Hu a spol. pripisoval MC závažnej degenerácii disku10. Kroc navrhol koncepciu „vnútornej ruptúry disku“, v ktorej sa uvádza, že opakovaná trauma disku môže viesť k mikrotrhlinám v koncovej platni. Po vytvorení rázštepu môže deštrukcia koncovej platničky nucleus pulposus (NP) spustiť autoimunitnú odpoveď, ktorá ďalej vedie k rozvoju MC11. Ma a spol. zdieľali podobný názor a uviedli, že NP-indukovaná autoimunita hrá kľúčovú úlohu v patogenéze MC12.
Bunky imunitného systému, najmä CD4+ T pomocné lymfocyty, hrajú rozhodujúcu úlohu v patogenéze autoimunity13. Nedávno objavená podskupina Th17 produkuje prozápalový cytokín IL-17, podporuje expresiu chemokínov a stimuluje T bunky v poškodených orgánoch, aby produkovali IFN-y14. Th2 bunky tiež hrajú jedinečnú úlohu v patogenéze imunitných odpovedí. Expresia IL-4 ako reprezentatívnej Th2 bunky môže viesť k závažným imunopatologickým následkom15.
Hoci na MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 bolo vykonaných mnoho klinických štúdií, stále je nedostatok vhodných zvieracích experimentálnych modelov, ktoré by mohli napodobňovať proces MC, ktorý sa často vyskytuje u ľudí a môže byť používa sa na skúmanie etiológie alebo nových liečebných postupov, ako je cielená liečba. Doteraz bolo hlásených len niekoľko zvieracích modelov MC, ktoré študovali základné patologické mechanizmy.
Na základe autoimunitnej teórie, ktorú navrhli Albert a Ma, táto štúdia vytvorila jednoduchý a reprodukovateľný model králičieho MC autotransplantáciou NP v blízkosti vŕtanej koncovej platničky stavca. Ďalšími cieľmi sú pozorovanie histologických charakteristík zvieracích modelov a vyhodnotenie špecifických mechanizmov NP vo vývoji MC. Na tento účel používame techniky, ako je molekulárna biológia, MRI a histologické štúdie na štúdium progresie MC.
Dva králiky zomreli na krvácanie počas operácie a štyri králiky zomreli počas anestézie počas MRI. Zvyšných 48 králikov prežilo a po operácii nevykazovali žiadne behaviorálne ani neurologické príznaky.
MRI ukazuje, že intenzita signálu vloženého tkaniva v rôznych otvoroch je rôzna. Intenzita signálu tela stavca L5 v skupine NPE sa postupne menila 12, 16 a 20 týždňov po vložení (sekvencia T1W vykazovala nízky signál a sekvencia T2W vykazovala zmiešaný signál plus nízky signál) (obr. 1C), zatiaľ čo MRI z ostatných dvoch skupín vložených častí zostali počas rovnakého obdobia relatívne stabilné (obr. 1A, B).
(A) Reprezentatívne sekvenčné MRI králičej bedrovej chrbtice v 3 časových bodoch. Na snímkach skupiny s falošnou operáciou sa nenašli žiadne abnormality signálu. (B) Charakteristiky signálu tela stavca v skupine ME sú podobné tým v skupine s falošnou operáciou a v priebehu času nie je pozorovaná žiadna významná zmena signálu v mieste vloženia. (C) V skupine NPE je nízky signál jasne viditeľný v sekvencii T1W a zmiešaný signál a nízky signál sú jasne viditeľné v sekvencii T2W. Od 12-týždňového do 20-týždňového obdobia sa sporadické vysoké signály obklopujúce nízke signály v sekvencii T2W znižujú.
Zjavnú kostnú hyperpláziu možno pozorovať v mieste implantácie tela stavca v skupine NPE a hyperplázia kosti sa vyskytuje rýchlejšie od 12 do 20 týždňov (obr. 2C) v porovnaní so skupinou NPE, v modelovanom stavci sa nepozorovala žiadna významná zmena telá; Falošná skupina a skupina ME (obr. 2C) 2A,B).
(A) Povrch tela stavca v implantovanej časti je veľmi hladký, otvor sa dobre hojí a v tele stavca nie je žiadna hyperplázia. (B) Tvar miesta implantácie v skupine ME je podobný ako v skupine so simulovanou operáciou a v priebehu času nie je zjavná žiadna zmena vzhľadu miesta implantácie. (C) Hyperplázia kostí sa vyskytla v mieste implantácie v skupine NPE. Hyperplázia kosti sa rýchlo zvýšila a dokonca sa rozšírila cez medzistavcovú platničku až do kontralaterálneho tela stavca.
Histologická analýza poskytuje podrobnejšie informácie o tvorbe kostí. Obrázok 3 ukazuje fotografie pooperačných rezov zafarbených H&E. V skupine s falošnou operáciou boli chondrocyty dobre usporiadané a nebola detegovaná žiadna bunková proliferácia (obr. 3A). Situácia v skupine ME bola podobná ako v skupine s falošnou operáciou (obr. 3B). V skupine NPE sa však v mieste implantácie pozoroval veľký počet chondrocytov a proliferácia buniek podobných NP (obr. 3C);
(A) Trabekuly sú viditeľné v blízkosti koncovej platne, chondrocyty sú úhľadne usporiadané s jednotnou veľkosťou a tvarom buniek a bez proliferácie (40-krát). (B) Stav miesta implantácie v skupine ME je podobný ako v skupine falošnej. Trabekuly a chondrocyty sú viditeľné, ale v mieste implantácie nie je zjavná proliferácia (40-krát). (B) Je možné vidieť, že chondrocyty a bunky podobné NP výrazne proliferujú a tvar a veľkosť chondrocytov sú nerovnomerné (40-krát).
Expresia mRNA interleukínu 4 (IL-4), mRNA interleukínu 17 (IL-17) a mRNA interferónu y (IFN-y) bola pozorovaná v skupinách NPE aj ME. Keď sa porovnávali hladiny expresie cieľových génov, génové expresie IL-4, IL-17 a IFN-γ boli významne zvýšené v skupine NPE v porovnaní so skupinou ME a skupinou s falošnou operáciou (obr. 4). (P < 0,05). V porovnaní so skupinou s falošnou operáciou sa hladiny expresie IL-4, IL-17 a IFN-γ v skupine ME zvýšili len mierne a nedosiahli štatistickú zmenu (P > 0,05).
Expresia mRNA IL-4, IL-17 a IFN-γ v skupine NPE vykazovala významne vyšší trend ako v skupine s falošnou operáciou a skupine ME (P < 0,05).
Na rozdiel od toho hladiny expresie v skupine ME nevykazovali žiadny významný rozdiel (P> 0,05).
Analýza Western blot sa uskutočnila s použitím komerčne dostupných protilátok proti IL-4 a IL-17 na potvrdenie zmeneného vzoru expresie mRNA. Ako je znázornené na obrázkoch 5A, B, v porovnaní so skupinou ME a skupinou s falošnou operáciou boli hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine NPE významne zvýšené (P < 0,05). V porovnaní so skupinou s falošnou operáciou hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine ME tiež nedosiahli štatisticky významné zmeny (P> 0,05).
(A) Hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine NPE boli významne vyššie ako hladiny v skupine ME a skupine s placebom (P < 0,05). (B) Histogram Western blot.
Vzhľadom na obmedzený počet ľudských vzoriek získaných počas operácie sú jasné a podrobné štúdie o patogenéze MC trochu ťažké. Pokúsili sme sa vytvoriť zvierací model MC na štúdium jeho potenciálnych patologických mechanizmov. Súčasne sa na sledovanie priebehu MC indukovanej NP autotransplantátom použilo rádiologické, histologické a molekulárne biologické hodnotenie. Výsledkom bolo, že model implantácie NP viedol k postupnej zmene intenzity signálu z 12-týždňových na 20-týždňových časových bodov (zmiešaný nízky signál v sekvenciách T1W a nízky signál v sekvenciách T2W), čo naznačuje zmeny tkaniva a histologické a molekulárne biologické hodnotenia potvrdili výsledky rádiologickej štúdie.
Výsledky tohto experimentu ukazujú, že vizuálne a histologické zmeny nastali v mieste poškodenia tela stavca v skupine NPE. Súčasne sa pozorovala expresia génov IL-4, IL-17 a IFN-γ, ako aj IL-4, IL-17 a IFN-γ, čo naznačuje, že narušenie autológneho pulpózneho tkaniva v vertebrálnom telo môže spôsobiť sériu signálnych a morfologických zmien. Je ľahké zistiť, že signálne charakteristiky tiel stavcov zvieracieho modelu (nízky signál v sekvencii T1W, zmiešaný signál a nízky signál v sekvencii T2W) sú veľmi podobné charakteristikám ľudských vertebrálnych buniek a charakteristiky MRI tiež potvrdili pozorovania histológie a hrubej anatómie, to znamená, že zmeny v bunkách tela stavca sú progresívne. Aj keď sa zápalová odpoveď spôsobená akútnou traumou môže objaviť krátko po punkcii, výsledky MRI ukázali, že progresívne sa zvyšujúce zmeny signálu sa objavili 12 týždňov po punkcii a pretrvávali až 20 týždňov bez akýchkoľvek známok zotavenia alebo zvrátenia zmien MRI. Tieto výsledky naznačujú, že autológna vertebrálna NP je spoľahlivou metódou na stanovenie progresívnej MV u králikov.
Tento model punkcie si vyžaduje primeranú zručnosť, čas a chirurgické úsilie. V predbežných experimentoch môže disekcia alebo nadmerná stimulácia paravertebrálnych väzivových štruktúr viesť k tvorbe vertebrálnych osteofytov. Je potrebné dávať pozor, aby ste nepoškodili alebo nepodráždili susedné disky. Keďže hĺbka prieniku musí byť kontrolovaná, aby sa dosiahli konzistentné a reprodukovateľné výsledky, ručne sme vyrobili zátku odrezaním puzdra ihly s dĺžkou 3 mm. Použitie tejto zátky zaisťuje rovnomernú hĺbku vŕtania v tele stavca. V predbežných experimentoch traja ortopedickí chirurgovia zapojení do operácie zistili, že 16-gauge ihly sa ľahšie používajú ako 18-gauge ihly alebo iné metódy. Aby sa predišlo nadmernému krvácaniu počas vŕtania, podržaním ihly na chvíľu v pokoji sa vytvorí vhodnejší zavádzací otvor, čo naznačuje, že určitý stupeň MC možno týmto spôsobom kontrolovať.
Hoci mnohé štúdie sa zamerali na MC, o etiológii a patogenéze MC sa vie len málo25,26,27. Na základe našich predchádzajúcich štúdií sme zistili, že autoimunita hrá kľúčovú úlohu vo výskyte a rozvoji MC12. Táto štúdia skúmala kvantitatívnu expresiu IL-4, IL-17 a IFN-y, čo sú hlavné diferenciačné dráhy CD4+ buniek po stimulácii antigénom. V našej štúdii v porovnaní s negatívnou skupinou mala skupina NPE vyššiu expresiu IL-4, IL-17 a IFN-γ a vyššie boli aj hladiny proteínov IL-4 a IL-17.
Klinicky je expresia mRNA IL-17 zvýšená v NP bunkách od pacientov s herniou disku28. Zvýšené hladiny expresie IL-4 a IFN-y boli tiež nájdené v modeli akútnej nekompresívnej herniácie disku v porovnaní so zdravými kontrolami29. IL-17 hrá kľúčovú úlohu pri zápale, poškodení tkaniva pri autoimunitných ochoreniach30 a zvyšuje imunitnú odpoveď na IFN-y31. Zosilnené poškodenie tkaniva sprostredkované IL-17 bolo hlásené u myší MRL/lpr32 a myší citlivých na autoimunitu33. IL-4 môže inhibovať expresiu prozápalových cytokínov (ako je IL-1p a TNFα) a aktiváciu makrofágov34. Bolo publikované, že expresia mRNA IL-4 bola odlišná v skupine NPE v porovnaní s IL-17 a IFN-y v rovnakom časovom bode; Expresia mRNA IFN-y v skupine NPE bola významne vyššia ako v ostatných skupinách. Preto produkcia IFN-y môže byť mediátorom zápalovej reakcie indukovanej interkaláciou NP. Štúdie ukázali, že IFN-γ je produkovaný viacerými typmi buniek, vrátane aktivovaných pomocných T buniek typu 1, prirodzených zabíjačských buniek a makrofágov35,36 a je kľúčovým prozápalovým cytokínom, ktorý podporuje imunitné reakcie37.
Táto štúdia naznačuje, že na výskyte a rozvoji MC sa môže podieľať autoimunitná odpoveď. Luoma a kol. zistili, že signálne charakteristiky MC a prominentného NP sú podobné na MRI a obe vykazujú vysoký signál v sekvencii T2W38. Bolo potvrdené, že niektoré cytokíny sú úzko spojené s výskytom MC, ako je IL-139. Ma a spol. naznačili, že vyčnievanie NP nahor alebo nadol môže mať veľký vplyv na výskyt a vývoj MC12. Bobechko40 a Herzbein et al.41 uviedli, že NP je imunotolerantné tkanivo, ktoré od narodenia nemôže vstúpiť do cievneho obehu. NP výbežky zavádzajú cudzie telesá do krvného zásobenia, čím sprostredkúvajú lokálne autoimunitné reakcie42. Autoimunitné reakcie môžu indukovať veľké množstvo imunitných faktorov a keď sú tieto faktory neustále vystavené tkanivám, môžu spôsobiť zmeny v signalizácii43. V tejto štúdii sú nadmerná expresia IL-4, IL-17 a IFN-y typickými imunitnými faktormi, čo ďalej dokazuje úzky vzťah medzi NP a MCs44. Tento zvierací model dobre napodobňuje NP prienik a vstup do koncovej platne. Tento proces ďalej odhalil vplyv autoimunity na MC.
Ako sa očakávalo, tento zvierací model nám poskytuje možnú platformu na štúdium MC. Tento model má však stále určité obmedzenia: po prvé, počas fázy pozorovania na zvieratách je potrebné utratiť niektorých králikov v strednom štádiu na histologické a molekulárno-biologické testovanie, takže niektoré zvieratá časom „vypadnú z používania“. Po druhé, aj keď sú v tejto štúdii stanovené tri časové body, žiaľ, modelovali sme iba jeden typ MC (zmena modického typu I), takže to nestačí na to, aby reprezentovalo proces vývoja ľudskej choroby, a je potrebné nastaviť viac časových bodov. lepšie sledovať všetky zmeny signálu. Po tretie, zmeny v štruktúre tkaniva môžu byť skutočne jasne preukázané histologickým farbením, ale niektoré špecializované techniky môžu lepšie odhaliť mikroštrukturálne zmeny v tomto modeli. Napríklad mikroskopia s polarizovaným svetlom sa použila na analýzu tvorby fibrochrupaviek v medzistavcových platničkách králikov45. Dlhodobé účinky NP na MC a koncovú platničku si vyžadujú ďalšiu štúdiu.
Päťdesiatštyri samcov novozélandských bielych králikov (hmotnosť približne 2,5-3 kg, vek 3-3,5 mesiaca) bolo náhodne rozdelených do skupiny simulovanej operácie, skupiny s implantáciou svalu (skupina ME) a skupiny s implantáciou nervových koreňov (skupina NPE). Všetky experimentálne postupy boli schválené Etickou komisiou nemocnice Tianjin a experimentálne metódy boli vykonávané v prísnom súlade so schválenými smernicami.
V chirurgickej technike S. Sobajima sa urobili určité zlepšenia46. Každý králik sa umiestnil do polohy ležmo na boku a predný povrch piatich po sebe idúcich lumbálnych medzistavcových platničiek (IVD) sa obnažil pomocou posterolaterálneho retroperitoneálneho prístupu. Každý králik dostal celkovú anestéziu (20 % uretán, 5 ml/kg cez ušnú žilu). Pozdĺžny kožný rez bol vedený od spodného okraja rebier po okraj panvy, 2 cm ventrálne od paravertebrálnych svalov. Pravá anterolaterálna chrbtica od L1 do L6 bola obnažená ostrou a tupou disekciou prekrývajúceho sa podkožného tkaniva, retroperitoneálneho tkaniva a svalov (obr. 6A). Úroveň disku sa určila pomocou okraja panvy ako anatomického orientačného bodu pre úroveň disku L5-L6. Použite punkčnú ihlu kalibru 16 na vyvŕtanie otvoru v blízkosti koncovej platničky stavca L5 do hĺbky 3 mm (obr. 6B). Na aspiráciu autológneho pulpózneho jadra v medzistavcovej platničke L1-L2 použite 5 ml injekčnú striekačku (obr. 6C). Odstráňte nucleus pulposus alebo sval podľa požiadaviek každej skupiny. Po prehĺbení vyvŕtaného otvoru sa na hlbokú fasciu, povrchovú fasciu a kožu umiestnia vstrebateľné stehy, pričom sa dbá na to, aby sa počas operácie nepoškodilo periostálne tkanivo tela stavca.
(A) Disk L5–L6 je exponovaný posterolaterálnym retroperitoneálnym prístupom. (B) Pomocou ihly 16 vyvŕtajte otvor v blízkosti koncovej platne L5. (C) Zberajú sa autológne MF.
Celková anestézia sa podávala s 20 % uretánom (5 ml/kg) podávaným cez ušnú žilu a röntgenové snímky bedrovej chrbtice sa opakovali 12, 16 a 20 týždňov po operácii.
Králiky boli usmrtené intramuskulárnou injekciou ketamínu (25,0 mg/kg) a intravenóznym pentobarbitalom sodným (1,2 g/kg) 12, 16 a 20 týždňov po operácii. Celá chrbtica bola odstránená na histologickú analýzu a bola vykonaná skutočná analýza. Na detekciu zmien imunitných faktorov sa použila kvantitatívna reverzná transkripcia (RT-qPCR) a Western blotting.
Vyšetrenia MRI sa uskutočňovali na králikoch s použitím klinického magnetu 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) vybaveného ortogonálnym cievkovým prijímačom končatiny. Králiky sa anestetizovali 20 % uretánom (5 ml/kg) cez ušnú žilu a potom sa umiestnili na chrbát do magnetu s lumbálnou oblasťou vycentrovanou na kruhovú povrchovú cievku s priemerom 5 palcov (GE Medical Systems). Boli získané koronálne T2 vážené lokalizačné snímky (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) na definovanie umiestnenia bedrového disku od L3–L4 po L5–L6. T2-vážené rezy v sagitálnej rovine sa získali s nasledujúcimi nastaveniami: rýchla sekvencia spin-echo s dobou opakovania (TR) 2200 ms a dobou ozveny (TE) 70 ms, matrica; zorné pole 260 a osem podnetov; Hrúbka rezu bola 2 mm, medzera bola 0,2 mm.
Potom, čo bola urobená posledná fotografia a posledný králik bol zabitý, boli na histologické vyšetrenie odstránené falošné, svalom uložené a NP disky. Tkanivá sa fixovali v 10% neutrálnom pufrovanom formalíne počas 1 týždňa, odvápnili sa kyselinou etyléndiamíntetraoctovou a narezali sa parafínom. Tkanivové bloky boli vložené do parafínu a narezané na sagitálne rezy (hrúbka 5 μm) pomocou mikrotómu. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E).
Po odbere medzistavcových platničiek od králikov v každej skupine sa celková RNA extrahovala pomocou kolóny UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Čína) podľa pokynov výrobcu a systému reverznej transkripcie ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Uskutočnila sa reverzná transkripcia.
RT-qPCR sa uskutočnilo s použitím Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) a SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) podľa pokynov výrobcu. Reakčný objem PCR bol 20 ul a obsahoval 1,5 ul zriedenej cDNA a 0,2 uM každého priméru. Primery boli navrhnuté OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) a vyrobené spoločnosťou Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Čína) (tabuľka 1). Boli použité nasledujúce podmienky tepelného cyklovania: počiatočný krok aktivácie polymerázy pri 94 °C počas 2 minút, potom 40 cyklov po 15 s každý pri 94 °C na denaturáciu templátu, žíhanie počas 1 minúty pri 60 °C, predĺženie a fluorescencia. merania sa uskutočňovali počas 1 minúty pri 72 °C. Všetky vzorky sa amplifikovali trikrát a priemerná hodnota sa použila na analýzu RT-qPCR. Amplifikačné dáta sa analyzovali pomocou FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Expresia génov IL-4, IL-17 a IFN-y bola normalizovaná na endogénnu kontrolu (ACTB). Relatívne hladiny expresie cieľovej mRNA sa vypočítali pomocou metódy 2-AACT.
Celkový proteín sa extrahoval z tkanív pomocou tkanivového homogenizátora v RIPA lyzovacom pufri (obsahujúcom koktail inhibítorov proteázy a fosfatázy) a potom sa centrifugoval pri 13 000 ot./min. počas 20 minút pri 4 °C, aby sa odstránili zvyšky tkaniva. Päťdesiat mikrogramov proteínu bolo nanesených na dráhu, oddelené 10% SDS-PAGE a potom prenesené na PVDF membránu. Blokovanie sa uskutočnilo v 5% odtučnenom sušenom mlieku v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) obsahujúcom 0,1% Tween 20 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Membrána bola inkubovaná s králičou anti-dekorínovou primárnou protilátkou (zriedená 1:200; Boster, Wuhan, Čína) (zriedená 1:200; Bioss, Peking, Čína) cez noc pri 4 °C a reagovala na druhý deň; so sekundárnou protilátkou (kozí anti-králičí imunoglobulín G v riedení 1:40 000) kombinovanou s chrenovou peroxidázou (Boster, Wuhan, Čína) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Signály Western blot sa detegovali zvýšenou chemiluminiscenciou na chemiluminiscenčnej membráne po rôntgenovom ožiarení. Na denzitometrickú analýzu sa bloty skenovali a kvantifikovali pomocou softvéru BandScan a výsledky sa vyjadrili ako pomer imunoreaktivity cieľového génu k imunoreaktivite tubulínu.
Štatistické výpočty sa uskutočnili pomocou softvérového balíka SPSS16.0 (SPSS, USA). Dáta zozbierané počas štúdie boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD) a analyzované pomocou jednosmernej analýzy rozptylu s opakovanými meraniami (ANOVA) na určenie rozdielov medzi týmito dvoma skupinami. P < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.
Vytvorenie zvieracieho modelu MC implantáciou autológnych NP do tela stavca a vykonaním makroanatomického pozorovania, analýzy MRI, histologického hodnotenia a molekulárnej biologickej analýzy sa teda môže stať dôležitým nástrojom na hodnotenie a pochopenie mechanizmov ľudskej MC a vývoj nových terapeutických zásahov.
Ako citovať tento článok: Han, C. et al. Zvierací model Modicových zmien bol vytvorený implantáciou autológneho nucleus pulposus do subchondrálnej kosti bedrovej chrbtice. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. a Boos, N. Zobrazovanie bedrovej chrbtice magnetickou rezonanciou: prevalencia herniácie a retencie disku, kompresia nervových koreňov, abnormality koncovej platničky a osteoartritída fazetového kĺbu u asymptomatických dobrovoľníkov . sadzba. Radiology 209, 661-666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS a Leboeuf-Eed, K. Modic zmeny a ich vzťah ku klinickým nálezom. European Spine Journal: oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre chrbticu, Európskej spoločnosti pre deformáciu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. a kol. Modické zmeny v bedrových vertebrálnych koncových platniach: prevalencia a súvislosť s bolesťou dolnej časti chrbta a ischiasom u mužov v strednom veku. Chrbtica 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. a Dalinka, M. MRI zmien kostnej drene v blízkosti koncovej platničky pri degeneratívnom ochorení driekovej chrbtice. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ a Carter, JR Degeneratívne ochorenie disku: hodnotenie zmien vertebrálnej drene pomocou MRI. Radiology 166, 193-199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS a Carter, JR Zobrazovanie degeneratívnych ochorení disku. Rádiológia 168, 177–186, doi: 10.1148/rádiológia.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, a kol. Prediktory signálnych zmien neovertebrálnej koncovej platničky (Modic) vo všeobecnej populácii. European Spine Journal: Oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre chrbticu, Európskej spoločnosti pre deformáciu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice, divízia 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB a Mannisch, K. Modické zmeny po herniácii bedrového disku. European Spine Journal : Oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre chrbticu, Európskej spoločnosti pre deformáciu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. a Kaapa, E. Modické zmeny typu I môžu predpovedať rýchlo progresívnu deformačnú degeneráciu disku: 1-ročná prospektívna štúdia. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ a Fan, SW Modické zmeny: možné príčiny a príspevok k degenerácii bedrového disku. Lekárske hypotézy 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Vnútorné prasknutie disku. Problémy s prolapsom disku po 50 rokoch. Chrbtica (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Čas odoslania: 13. decembra 2024