Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame používať novší prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Vytvorenie zvieracích modelov modických zmien (MC) je dôležitým základom pre štúdium MC. Päťdesiatštyri novozélandských bielych králikov bolo rozdelených do skupiny s simulovanou operáciou, skupiny s implantáciou svalu (ME skupina) a skupiny s implantáciou nucleus pulposus (NPE skupina). V skupine NPE bola medzistavcová platnička odkrytá anterolaterálnym lumbálnym chirurgickým prístupom a ihla bola použitá na prepichnutie tela stavca L5 v blízkosti koncovej platničky. NP bol extrahovaný z medzistavcovej platničky L1/2 injekčnou striekačkou a vstreknutý do nej. Vyvŕtanie otvoru v subchondrálnej kosti. Chirurgické postupy a metódy vŕtania v skupine s implantáciou svalu a skupine s simulovanou operáciou boli rovnaké ako v skupine s implantáciou NP. V skupine ME bol do otvoru umiestnený kúsok svalu, zatiaľ čo v skupine s simulovanou operáciou nebol do otvoru umiestnený žiadny kus. Po operácii sa vykonalo MRI vyšetrenie a molekulárno-biologické testovanie. Signál v skupine NPE sa zmenil, ale v skupine s simulovanou operáciou a ME skupine nedošlo k žiadnej zjavnej zmene signálu. Histologické pozorovanie ukázalo, že v mieste implantácie bola pozorovaná abnormálna proliferácia tkaniva a v skupine NPE bola zvýšená expresia IL-4, IL-17 a IFN-γ. Implantácia NP do subchondrálnej kosti môže vytvoriť zvierací model MC.
Modické zmeny (MC) sú lézie koncových platničiek stavcov a priľahlej kostnej drene viditeľné na magnetickej rezonancii (MRI). Sú pomerne časté u jedincov s pridruženými príznakmi1. Mnohé štúdie zdôraznili dôležitosť MC kvôli jej súvislosti s bolesťou dolnej časti chrbta (LBP)2,3. de Roos a kol.4 a Modic a kol.5 nezávisle od seba ako prví opísali tri rôzne typy abnormalít subchondrálneho signálu v kostnej dreni stavcov. Modické zmeny typu I sú hypointenzívne na T1-vážených (T1W) sekvenciách a hyperintenzívne na T2-vážených (T2W) sekvenciách. Táto lézia odhaľuje fisúrne koncové platničky a priľahlé vaskulárne granulačné tkanivo v kostnej dreni. Modické zmeny typu II vykazujú vysoký signál na T1W aj T2W sekvenciách. V tomto type lézie možno nájsť deštrukciu koncových platničiek, ako aj histologickú tukovú náhradu priľahlej kostnej drene. Modické zmeny typu III vykazujú nízky signál v T1W a T2W sekvenciách. Pozorovali sa sklerotické lézie zodpovedajúce koncovým platničkám6. MC sa považuje za patologické ochorenie chrbtice a úzko súvisí s mnohými degeneratívnymi ochoreniami chrbtice7,8,9.
Vzhľadom na dostupné údaje poskytlo niekoľko štúdií podrobný pohľad na etiológiu a patologické mechanizmy vzniku mikrocelulárnej adenokarcíny (MC). Albert a kol. naznačili, že MC môže byť spôsobená herniáciou disku8. Hu a kol. pripísali MC ťažkej degenerácii disku10. Kroc navrhol koncept „vnútornej ruptúry disku“, ktorý uvádza, že opakované traumy disku môžu viesť k mikrotrhlinám v koncovej platničke. Po vytvorení štrbiny môže deštrukcia koncovej platničky nucleus pulposus (NP) spustiť autoimunitnú odpoveď, ktorá ďalej vedie k rozvoju MC11. Ma a kol. zdieľali podobný názor a uviedli, že autoimunita indukovaná NP zohráva kľúčovú úlohu v patogenéze MC12.
Bunky imunitného systému, najmä pomocné T lymfocyty CD4+, zohrávajú kľúčovú úlohu v patogenéze autoimunity13. Nedávno objavená podskupina Th17 produkuje prozápalový cytokín IL-17, podporuje expresiu chemokínov a stimuluje T bunky v poškodených orgánoch k produkcii IFN-γ14. Bunky Th2 tiež zohrávajú jedinečnú úlohu v patogenéze imunitných odpovedí. Expresia IL-4 ako reprezentatívnej bunky Th2 môže viesť k závažným imunopatologickým následkom15.
Hoci sa uskutočnilo mnoho klinických štúdií s MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, stále chýbajú vhodné experimentálne modely na zvieratách, ktoré by dokázali napodobniť proces MC, ktorý sa často vyskytuje u ľudí, a ktoré by sa mohli použiť na skúmanie etiológie alebo nových liečebných postupov, ako je cielená terapia. Doteraz bolo publikovaných len niekoľko zvieracích modelov MC, ktoré by študovali základné patologické mechanizmy.
Na základe autoimunitnej teórie navrhnutej Albertom a Ma táto štúdia vytvorila jednoduchý a reprodukovateľný model králičej miechy (MC) autotransplantáciou NP v blízkosti vyvŕtanej koncovej platničky stavca. Ďalšími cieľmi je pozorovať histologické charakteristiky zvieracích modelov a vyhodnotiť špecifické mechanizmy NP pri vývoji MC. Na tento účel používame techniky ako molekulárna biológia, MRI a histologické štúdie na štúdium progresie MC.
Dva králiky uhynuli na krvácanie počas operácie a štyri králiky uhynuli počas anestézie počas vyšetrenia magnetickou rezonanciou. Zvyšných 48 králikov prežilo a po operácii nevykazovali žiadne behaviorálne ani neurologické príznaky.
MRI ukazuje, že intenzita signálu vloženého tkaniva v rôznych otvoroch je odlišná. Intenzita signálu tela stavca L5 v skupine NPE sa postupne menila 12, 16 a 20 týždňov po zavedení (sekvencia T1W vykazovala nízky signál a sekvencia T2W vykazovala zmiešaný signál plus nízky signál) (Obr. 1C), zatiaľ čo vzhľad MRI ostatných dvoch skupín vložených častí zostal počas rovnakého obdobia relatívne stabilný (Obr. 1A, B).
(A) Reprezentatívne sekvenčné MRI snímky bedrovej chrbtice králika v 3 časových bodoch. Na snímkach skupiny s placebom sa nezistili žiadne abnormality signálu. (B) Charakteristiky signálu tela stavca v skupine ME sú podobné ako v skupine s placebom a v mieste zavedenia sa v priebehu času nepozorovala žiadna významná zmena signálu. (C) V skupine NPE je nízky signál jasne viditeľný v sekvencii T1W a zmiešaný signál a nízky signál sú jasne viditeľné v sekvencii T2W. Od 12. do 20. týždňa sa sporadické vysoké signály obklopujúce nízke signály v sekvencii T2W znižujú.
V skupine NPE je možné pozorovať zjavnú kostnú hyperpláziu v mieste implantácie tela stavca a kostná hyperplázia sa vyskytuje rýchlejšie od 12 do 20 týždňov (obr. 2C) v porovnaní so skupinou NPE, v modelovaných telách stavcov sa nepozoruje žiadna významná zmena; skupina Sim a skupina ME (obr. 2C) 2A,B).
(A) Povrch tela stavca v implantovanej časti je veľmi hladký, otvor sa dobre hojí a v tele stavca nie je žiadna hyperplázia. (B) Tvar implantovaného miesta v skupine ME je podobný tvaru v skupine s falošnou operáciou a v priebehu času nedochádza k žiadnej zjavnej zmene vzhľadu implantovaného miesta. (C) V skupine NPE sa v implantovanom mieste vyskytla hyperplázia kosti. Hyperplázia kosti sa rýchlo zvýšila a dokonca sa rozšírila cez medzistavcovú platničku do kontralaterálneho tela stavca.
Histologická analýza poskytuje podrobnejšie informácie o tvorbe kostí. Obrázok 3 zobrazuje fotografie pooperačných rezov zafarbených H&E. V skupine s placebom boli chondrocyty dobre usporiadané a nebola zistená žiadna proliferácia buniek (obr. 3A). Situácia v skupine ME bola podobná ako v skupine s placebom (obr. 3B). V skupine NPE sa však v mieste implantácie pozoroval veľký počet chondrocytov a proliferácia buniek podobných NP (obr. 3C);
(A) Trabekuly sú viditeľné v blízkosti koncovej platničky, chondrocyty sú úhľadne usporiadané s jednotnou veľkosťou a tvarom buniek a bez proliferácie (40-krát). (B) Stav miesta implantácie v skupine ME je podobný ako v skupine s placebom. Trabekuly a chondrocyty sú viditeľné, ale v mieste implantácie nie je zjavná proliferácia (40-krát). (B) Je vidieť, že chondrocyty a bunky podobné NP sa významne proliferujú a tvar a veľkosť chondrocytov sú nerovnomerné (40-krát).
Expresia mRNA interleukínu 4 (IL-4), mRNA interleukínu 17 (IL-17) a mRNA interferónu γ (IFN-γ) bola pozorovaná v skupine NPE aj ME. Pri porovnaní hladín expresie cieľových génov bola génová expresia IL-4, IL-17 a IFN-γ v skupine NPE významne zvýšená v porovnaní so skupinou ME a skupinou s placebom (Obr. 4) (P < 0,05). V porovnaní so skupinou s placebom sa hladiny expresie IL-4, IL-17 a IFN-γ v skupine ME zvýšili len mierne a nedosiahli štatistickú zmenu (P > 0,05).
Expresia mRNA IL-4, IL-17 a IFN-γ v skupine NPE vykazovala významne vyšší trend ako v skupine so simulovanou operáciou a skupine ME (P < 0,05).
Naopak, hladiny expresie v skupine ME nevykazovali žiadny významný rozdiel (P>0,05).
Na potvrdenie zmeneného vzoru expresie mRNA sa vykonala Western blot analýza s použitím komerčne dostupných protilátok proti IL-4 a IL-17. Ako je znázornené na obrázkoch 5A a B, v porovnaní so skupinou ME a skupinou s placebom boli hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine NPE významne zvýšené (P < 0,05). V porovnaní so skupinou s placebom hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine ME tiež nedosiahli štatisticky významné zmeny (P > 0,05).
(A) Hladiny proteínov IL-4 a IL-17 v skupine NPE boli významne vyššie ako v skupine ME a skupine s placebom (P < 0,05). (B) Histogram Western blotu.
Vzhľadom na obmedzený počet ľudských vzoriek získaných počas chirurgického zákroku sú jasné a podrobné štúdie patogenézy MC do istej miery zložité. Pokúsili sme sa vytvoriť zvierací model MC na štúdium jej potenciálnych patologických mechanizmov. Zároveň sme použili rádiologické, histologické a molekulárno-biologické vyšetrenie na sledovanie priebehu MC indukovanej autotransplantátom NP. Výsledkom bolo, že model implantácie NP viedol k postupnej zmene intenzity signálu od 12. do 20. týždňa (zmiešaný nízky signál v sekvenciách T1W a nízky signál v sekvenciách T2W), čo naznačuje zmeny v tkanive, a histologické a molekulárne-biologické vyšetrenia potvrdili výsledky rádiologickej štúdie.
Výsledky tohto experimentu ukazujú, že v mieste porušenia tela stavca v skupine NPE došlo k vizuálnym a histologickým zmenám. Zároveň sa pozorovala expresia génov IL-4, IL-17 a IFN-γ, ako aj IL-4, IL-17 a IFN-γ, čo naznačuje, že porušenie autológneho tkaniva nucleus pulposus v tele stavca môže spôsobiť sériu signálnych a morfologických zmien. Je ľahké zistiť, že signálne charakteristiky tiel stavcov zvieracieho modelu (nízky signál v sekvencii T1W, zmiešaný signál a nízky signál v sekvencii T2W) sú veľmi podobné charakteristikám ľudských buniek stavcov a charakteristiky MRI tiež potvrdzujú pozorovania histológie a hrubej anatómie, to znamená, že zmeny v bunkách tela stavcov sú progresívne. Hoci sa zápalová reakcia spôsobená akútnou traumou môže objaviť krátko po punkcii, výsledky MRI ukázali, že progresívne rastúce zmeny signálu sa objavili 12 týždňov po punkcii a pretrvávali až 20 týždňov bez akýchkoľvek známok zotavenia alebo zvrátenia zmien MRI. Tieto výsledky naznačujú, že autológna vertebrálna NP je spoľahlivou metódou na stanovenie progresívnej mikrovalovej ventilácie u králikov.
Tento model vpichu vyžaduje primerané zručnosti, čas a chirurgické úsilie. V predbežných experimentoch môže disekcia alebo nadmerná stimulácia paravertebrálnych väzivových štruktúr viesť k tvorbe stavcových osteofytov. Treba dbať na to, aby sa nepoškodili alebo nepodráždili susedné platničky. Keďže hĺbka penetrácie musí byť kontrolovaná, aby sa dosiahli konzistentné a reprodukovateľné výsledky, manuálne sme vyrobili zátku odrezaním puzdra 3 mm dlhej ihly. Použitie tejto zátky zaisťuje rovnomernú hĺbku vŕtania v tele stavca. V predbežných experimentoch traja ortopedickí chirurgovia zapojení do operácie zistili, že s ihlami kalibru 16 sa pracuje ľahšie ako s ihlami kalibru 18 alebo inými metódami. Aby sa predišlo nadmernému krvácaniu počas vŕtania, podržanie ihly v pokoji na chvíľu poskytne vhodnejší vstupný otvor, čo naznačuje, že týmto spôsobom je možné kontrolovať určitý stupeň MC.
Hoci sa mnoho štúdií zameralo na MC, o etiológii a patogenéze MC25,26,27 je známe len málo. Na základe našich predchádzajúcich štúdií sme zistili, že autoimunita hrá kľúčovú úlohu vo výskyte a rozvoji MC12. Táto štúdia skúmala kvantitatívnu expresiu IL-4, IL-17 a IFN-γ, ktoré sú hlavnými diferenciačnými dráhami buniek CD4+ po stimulácii antigénom. V našej štúdii mala skupina NPE v porovnaní s negatívnou skupinou vyššiu expresiu IL-4, IL-17 a IFN-γ a hladiny proteínov IL-4 a IL-17 boli tiež vyššie.
Klinicky je expresia mRNA IL-17 zvýšená v NP bunkách od pacientov s herniáciou disku28. Zvýšené hladiny expresie IL-4 a IFN-γ boli tiež zistené v modeli akútnej nekompresívnej hernie disku v porovnaní so zdravými kontrolami29. IL-17 hrá kľúčovú úlohu pri zápale, poškodení tkaniva pri autoimunitných ochoreniach30 a zvyšuje imunitnú odpoveď na IFN-γ31. Zvýšené poškodenie tkaniva sprostredkované IL-17 bolo hlásené u myší MRL/lpr32 a myší citlivých na autoimunitu33. IL-4 môže inhibovať expresiu prozápalových cytokínov (ako sú IL-1β a TNFα) a aktiváciu makrofágov34. Bolo hlásené, že expresia mRNA IL-4 bola v skupine NPE odlišná v porovnaní s IL-17 a IFN-γ v rovnakom časovom bode; expresia mRNA IFN-γ v skupine NPE bola významne vyššia ako v ostatných skupinách. Preto môže byť produkcia IFN-γ mediátorom zápalovej odpovede vyvolanej interkaláciou NP. Štúdie ukázali, že IFN-γ je produkovaný viacerými typmi buniek vrátane aktivovaných pomocných T buniek typu 1, prirodzených zabíjačských buniek a makrofágov35,36 a je kľúčovým prozápalovým cytokínom, ktorý podporuje imunitné reakcie37.
Táto štúdia naznačuje, že autoimunitná odpoveď môže byť zapojená do výskytu a rozvoja MC. Luoma a kol. zistili, že signálne charakteristiky MC a prominentných NP sú na MRI podobné a obe vykazujú vysoký signál v sekvencii T2W38. Potvrdilo sa, že niektoré cytokíny, ako napríklad IL-139, úzko súvisia s výskytom MC. Ma a kol. naznačili, že vyčnievanie NP smerom nahor alebo nadol môže mať veľký vplyv na výskyt a rozvoj MC12. Bobechko40 a Herzbein a kol.41 uviedli, že NP je imunotolerantné tkanivo, ktoré nemôže vstúpiť do cievneho obehu od narodenia. Vyčnievanie NP zavádza cudzie telesá do krvného obehu, čím sprostredkováva lokálne autoimunitné reakcie42. Autoimunitné reakcie môžu indukovať veľké množstvo imunitných faktorov a keď sú tieto faktory kontinuálne vystavené tkanivám, môžu spôsobiť zmeny v signalizácii43. V tejto štúdii je nadmerná expresia IL-4, IL-17 a IFN-γ typickými imunitnými faktormi, čo ďalej dokazuje úzky vzťah medzi NP a MC44. Tento zvierací model dobre napodobňuje prienik NP a vstup do koncovej platničky. Tento proces ďalej odhalil vplyv autoimunity na MC.
Ako sa očakávalo, tento zvierací model nám poskytuje možnú platformu na štúdium mikrochrupaviek (MC). Tento model má však stále určité obmedzenia: po prvé, počas fázy pozorovania zvierat je potrebné niektoré králiky v strednom štádiu vývoja utratiť na histologické a molekulárno-biologické testovanie, takže niektoré zvieratá časom „stratia svoju účinnosť“. Po druhé, hoci sú v tejto štúdii stanovené tri časové body, bohužiaľ sme modelovali iba jeden typ MC (zmena typu I podľa Modica), takže to nestačí na znázornenie procesu vývoja ľudského ochorenia a na lepšie pozorovanie všetkých zmien signálu je potrebné nastaviť viac časových bodov. Po tretie, zmeny v štruktúre tkaniva možno skutočne jasne zobraziť histologickým farbením, ale niektoré špecializované techniky dokážu lepšie odhaliť mikroštrukturálne zmeny v tomto modeli. Napríklad na analýzu tvorby fibrochrupaviek v medzistavcových platničkách králikov sa použila mikroskopia s polarizovaným svetlom45. Dlhodobé účinky NP na MC a koncovú platničku si vyžadujú ďalšie štúdium.
Päťdesiatštyri samcov novozélandských bielych králikov (hmotnosť približne 2,5 – 3 kg, vek 3 – 3,5 mesiaca) bolo náhodne rozdelených do skupiny s fiktívnou operáciou, skupiny s implantáciou svalu (skupina ME) a skupiny s implantáciou nervového koreňa (skupina NPE). Všetky experimentálne postupy boli schválené etickou komisiou nemocnice Tianjin a experimentálne metódy boli vykonané v prísnom súlade so schválenými smernicami.
V chirurgickej technike S. Sobajimu 46 sa dosiahli určité vylepšenia. Každý králik bol umiestnený do bočnej polohy v ľahu a predná plocha piatich po sebe idúcich bedrových medzistavcových platničiek (IVD) bola odkrytá posterolaterálnym retroperitoneálnym prístupom. Každému králikovi bola podaná celková anestézia (20 % uretán, 5 ml/kg cez ušnú žilu). Pozdĺžny rez kože bol urobený od dolného okraja rebier po panvový okraj, 2 cm ventrálne od paravertebrálnych svalov. Pravá anterolaterálna chrbtica od L1 po L6 bola odkrytá ostrou a tupou disekciou nadložného podkožného tkaniva, retroperitoneálneho tkaniva a svalov (obr. 6A). Úroveň platničky bola určená pomocou panvového okraja ako anatomického orientačného bodu pre úroveň platničky L5-L6. Pomocou punkčnej ihly kalibru 16 vyvŕtajte otvor v blízkosti koncovej platničky stavca L5 do hĺbky 3 mm (obr. 6B). Na aspiráciu autológneho nucleus pulposus z medzistavcovej platničky L1-L2 použite 5 ml injekčnú striekačku (obr. 6C). Odstráňte nucleus pulposus alebo sval podľa požiadaviek každej skupiny. Po prehĺbení vŕtaného otvoru sa na hlbokú fasciu, povrchovú fasciu a kožu umiestnia vstrebateľné stehy, pričom sa dáva pozor, aby sa počas operácie nepoškodilo periostálne tkanivo tela stavca.
(A) Disk L5–L6 sa odkryje posterolaterálnym retroperitoneálnym prístupom. (B) Na vyvŕtanie otvoru v blízkosti koncovej platničky L5 sa použije ihla kalibru 16. (C) Odoberú sa autológne MF.
Celková anestézia bola podaná 20% uretánom (5 ml/kg) podaným cez ušnú žilu a röntgenové snímky bedrovej chrbtice boli opakované 12, 16 a 20 týždňov po operácii.
Králiky boli usmrtené intramuskulárnou injekciou ketamínu (25,0 mg/kg) a intravenóznym podaním pentobarbitalu sodného (1,2 g/kg) v 12., 16. a 20. týždni po operácii. Celá chrbtica bola odstránená na histologickú analýzu a bola vykonaná skutočná analýza. Na detekciu zmien imunitných faktorov bola použitá kvantitatívna reverzná transkripcia (RT-qPCR) a Western blotting.
MRI vyšetrenia sa vykonali na králikoch s použitím klinického magnetu s výkonom 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) vybaveného ortogonálnym prijímačom cievky do končatín. Králiky sa anestetizovali 20 % uretánom (5 ml/kg) cez ušnú žilu a potom sa umiestnili na chrbát do magnetu s bedrovou oblasťou vycentrovanou na kruhovej povrchovej cievke s priemerom 5 palcov (GE Medical Systems). Na definovanie polohy bedrovej platničky od L3–L4 do L5–L6 sa získali koronálne T2-vážené lokalizačné snímky (TR, 1445 ms; TE, 37 ms). Sagitálne rovinné T2-vážené rezy sa získali s nasledujúcimi nastaveniami: rýchla spin-echo sekvencia s časom opakovania (TR) 2200 ms a časom echa (TE) 70 ms, matica; zorné pole 260 a osem stimulov; hrúbka rezu bola 2 mm, medzera bola 0,2 mm.
Po urobení poslednej fotografie a usmrtení posledného králika boli simulované, svalovo-zaliate a NP disky vybraté na histologické vyšetrenie. Tkanivá boli fixované v 10 % neutrálnom pufrovanom formalíne počas 1 týždňa, dekalcifikované kyselinou etyléndiamíntetraoctovou a narezané v parafíne. Bloky tkaniva boli zaliate do parafínu a narezané na sagitálne rezy (hrúbka 5 μm) pomocou mikrotómu. Rezy boli farbené hematoxylínom a eozínom (H&E).
Po odobratí medzistavcových platničiek od králikov v každej skupine bola celková RNA extrahovaná pomocou kolóny UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Čína) podľa pokynov výrobcu a systému reverznej transkripcie ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). Bola vykonaná reverzná transkripcia.
RT-qPCR sa uskutočnila s použitím prístroja Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) a SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) podľa pokynov výrobcu. Objem PCR reakcie bol 20 μl a obsahoval 1,5 μl zriedenej cDNA a 0,2 μM každého primeru. Primery navrhla spoločnosť OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) a vyrobila ich spoločnosť Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Čína) (Tabuľka 1). Použili sa nasledujúce podmienky tepelných cyklov: počiatočný krok aktivácie polymerázy pri 94 °C počas 2 minút, potom 40 cyklov po 15 sekundách pri 94 °C pre denaturáciu templátu, žíhanie počas 1 minúty pri 60 °C, extenzia a fluorescencia. Merania sa uskutočnili počas 1 minúty pri 72 °C. Všetky vzorky sa amplifikovali trikrát a priemerná hodnota sa použila na analýzu RT-qPCR. Dáta amplifikácie boli analyzované pomocou programu FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Expresia génov IL-4, IL-17 a IFN-γ bola normalizovaná vzhľadom na endogénnu kontrolu (ACTB). Relatívne hladiny expresie cieľovej mRNA boli vypočítané pomocou metódy 2-ΔΔCT.
Celkový proteín bol extrahovaný z tkanív pomocou tkanivového homogenizátora v RIPA lyzačnom pufri (obsahujúcom kokteil inhibítorov proteázy a fosfatázy) a potom centrifugovaný pri 13 000 otáčkach za minútu počas 20 minút pri 4 °C, aby sa odstránili tkanivové zvyšky. Do každej dráhy bolo nanesených päťdesiat mikrogramov proteínu, separovaných pomocou 10 % SDS-PAGE a potom prenesených na PVDF membránu. Blokovanie sa uskutočnilo v 5 % odtučnenom sušenom mlieku v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) obsahujúcom 0,1 % Tween 20 počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Membrána bola inkubovaná s primárnou protilátkou králika proti dekorínu (riedená 1:200; Boster, Wuhan, Čína) (riedená 1:200; Bioss, Peking, Čína) cez noc pri 4 °C a reagovala druhý deň; so sekundárnou protilátkou (kozí anti-králičí imunoglobulín G v riedení 1:40 000) v kombinácii s chrenovou peroxidázou (Boster, Wuhan, Čína) počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Signály Western blotu boli detegované zvýšenou chemiluminiscenciou na chemiluminiscenčnej membráne po ožiarení röntgenovým žiarením. Pre denzitometrickú analýzu boli bloty skenované a kvantifikované pomocou softvéru BandScan a výsledky boli vyjadrené ako pomer imunoreaktivity cieľového génu k imunoreaktivite tubulínu.
Štatistické výpočty boli vykonané pomocou softvérového balíka SPSS16.0 (SPSS, USA). Údaje zozbierané počas štúdie boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD) a analyzované pomocou jednofaktorovej analýzy rozptylu s opakovanými meraniami (ANOVA) na určenie rozdielov medzi týmito dvoma skupinami. Hodnota P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Vytvorenie zvieracieho modelu MC implantáciou autológnych NP do tela stavca a vykonaním makroanatomického pozorovania, MRI analýzy, histologického vyhodnotenia a molekulárno-biologickej analýzy sa teda môže stať dôležitým nástrojom na posúdenie a pochopenie mechanizmov ľudskej MC a vývoj nových terapeutických intervencií.
Ako citovať tento článok: Han, C. a kol. Zvierací model Modicových zmien bol vytvorený implantáciou autológneho nucleus pulposus do subchondrálnej kosti bedrovej chrbtice. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. a Boos, N. Magnetická rezonancia bedrovej chrbtice: prevalencia hernie a retencie disku, kompresia nervových koreňov, abnormality koncových platničiek a osteoartróza fazetového kĺbu u asymptomatických dobrovoľníkov. Rate. Rádiológia 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS a Leboeuf-Eed, K. Modicove zmeny a ich vzťah ku klinickým nálezom. European Spine Journal: oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre spinálnu deformitu, Európskej spoločnosti pre deformitu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. a kol. Modifikované zmeny v koncových platničkách bedrových stavcov: prevalencia a súvislosť s bolesťami dolnej časti chrbta a ischiasom u mužských pracovníkov stredného veku. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. a Dalinka, M. MRI zmien kostnej drene v blízkosti koncovej platničky pri degeneratívnom ochorení bedrovej chrbtice. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ a Carter, JR Degeneratívne ochorenie platničiek: hodnotenie zmien stavcovej drene pomocou MRI. Rádiológia 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS a Carter, JR Zobrazovanie degeneratívneho ochorenia platničiek. Rádiológia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS a kol. Prediktory neovertebrálnych koncových platničiek (Modic) signalizujú zmeny v bežnej populácii. European Spine Journal: Oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre spinálnu chorobu, Európskej spoločnosti pre deformitu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice, divízia 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB a Mannisch, K. Modicove zmeny po herniácii bedrového disku. European Spine Journal: Oficiálna publikácia Európskej spoločnosti pre spinálnu chrbticu, Európskej spoločnosti pre deformitu chrbtice a Európskej spoločnosti pre výskum krčnej chrbtice 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. a Kaapa, E. Zmeny typu I v modiku môžu predpovedať rýchlo progresívnu deformačnú degeneráciu disku: ročná prospektívna štúdia. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ a Fan, SW Modicove zmeny: možné príčiny a príspevok k degenerácii bedrovej platničky. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Vnútorná ruptúra platničky. Problémy s prolapsom platničky po 50 rokoch. Chrbtica (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Čas uverejnenia: 13. decembra 2024